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红曲的传统与现代研究

作者:天曲生物 日期:2020-10-02 15:03:57 点击数:2

红曲的传统与现代研究


邢旺兴1 郑筱祥1 陈士景2


(1浙江大学生物医学工程与仪器科学学院 杭州 310027)

(2中国人民解放军第117医院 杭州 310013)


摘要:阐述了国内外红曲及其基原真菌研究的最新动态,包括红曲霉的分类地位、红曲传统与现代研究、红曲化学成分、工艺条件优化、成分分析、药理作用的研究概况,并对红曲的研究开发前景进行了展望。


关键词:红曲,红曲霉,化学成分,药理作用


随着人们生活水平的提高,高血压伴生高脂血症已成为文明社会的常见多发及慢性中老年人疾病。但具降血压、降血脂双重作用的药物并不很多,红曲是一种食疗兼备的传统中药,是我国先人巧夺天工的伟大发明,是祖国宝贵的科学文化遗产。本品性温、味甘,具有活血化瘀、健脾消食之功效,主治产后恶露不净、瘀滞腹痛、食积饱胀、赤白下痢、跌打损伤等症[1]。历代诸家对红曲的功效看法一致。随着从红曲的发酵产物中筛选出强效降血脂成分之后,红曲的保健疗效和治病功能正在倍受世人的关注。现代研究表明,红曲同时含有降血脂、降血压、降血糖等生理活性物质,具有重大的开发价值,前景无限广阔。本文就红曲研究、生产及应用的发展与现状概述如下。


1红曲与红曲霉

红曲为红曲霉属真菌接种于蒸熟的大米上发酵而成,其色赤红,故又名赤曲、红米、红大米、红曲米、红糟,又因主产于福建等地,故又名福曲、福米等[2~3]。红曲霉属Monascus van Tieghem为van Tieghem于1884年建立的属,百余年来文献中曾记述过20余种,其中已报道过制备红曲的菌种有6种:紫红曲霉Monascus purpureus Went、红曲红曲霉M. anka nokazawaet Sato、巴克红曲霉M. barkeri Dangerd、红色红曲霉M. ruber van Tieghem、变红红曲霉M. rubropunctatus Sato、烟色红曲霉M. fuliginosus Sato等,但习惯上供药用的大多为紫色红曲霉M. purpureus Went[2]。红曲霉属腐生菌,嗜酸,特别喜乳酸,耐高温,耐乙酸。它们多出现在乳酸自然发酵的基物中。大曲、制曲作坊、酿酒醪液,青贮饲料,泡菜、淀粉厂等都是适用于它们繁殖的场所。红曲霉生长最适温度为32-35℃,最适pH为3.5-5.0,能耐pH2.5,耐10%乙醇。它们可以利用多种碳源、氮源,并能在自身合成生物素、泛酸、核黄素等,故在无维生素的合成培养基中能生长。一般红曲霉能产生鲜艳的红色色素,所以我国多用它们培制红曲、生成葡萄糖淀粉酶等。

紫红曲霉在麦芽汁琼脂上,菌落成膜状的蔓延生长物,表面有皱纹和气生菌丝。菌丝体初白色或粉色,老熟后红紫色或葡萄酱紫色。菌落背面紫红色。显微镜下观察:菌丝分枝、有隔、多核,含橙红色颗粒,直径3~7μm。分生孢子单生或成链,球形或梨形,直径6~9μm,或9~11μm×6~9μm。团囊壳橙红色,球形,直径25~75μm。子囊球形,含8个子囊孢子,成熟后即消失。子囊孢子卵圆形、光滑、无色或淡红色,5~6.5μm×3.5~5μm[4]。

关于红曲霉属的命名在分类学上尚有不完备的地方,至今国际上没有统一标准,对某些独立的种,仍有异议。我国专家认为红曲霉属于曲霉科,日本专家认为属于半子囊菌科。刘波(1978)、戴芳澜(1987)均采用了Martin分类系统,将红曲霉属归于真菌门(Fungi),子囊菌纲(Ascomycetes),真子囊菌亚纲(Euascomycetes)、曲霉目即散囊菌目(Eurotiales)、曲霉科即散囊菌科(Eurotiaceae);而俞大绂(1985)、张纪忠(1990)等采用了Ainsworth分类系统,这也是目前多数真菌学者趋向参照的分类系统,将红曲霉属归于真菌界(The Fungi)、真菌门(Eumycota)、子囊菌亚门(Ascomycotina)、不整囊菌纲(Plectomyhcetes)、散囊菌目(Eurtotiales)、红曲科(Monascaceae)。在此,于散囊菌目下建立红曲科,从而与散囊菌科分开,红曲科下仅一属即为红曲霉属[5]。陈驹声(1982)将红曲霉属归于半子囊菌纲(Hemiascomycetes)下[6],与大多数学者的分类归属不一致,可见是不妥当的。

近来Hawksworth DL等依据产生色素和酶的特性,又提出了一种新的分类法。将Monascus属分为四:M.pilosus,M.purpureus,M.ruber和M.floridanus[7]。同样,在我国省市的中药材炮制规范中,关于制造药用红曲的菌种问题,也仍有含糊不清、自相矛盾的说法。有时讲红曲是将粳米倒入红色土层中三、四年后而成,有时又说是纯菌种紫色红曲霉Monascus purpureus Went纯培养的报道。然而《本草纲目》中“消食活血,健脾燥胃”的功效都一直沿用至今,这可能是所有红曲霉菌的共同属性。


2古代中国对红曲的研究和利用

红曲既是中药材,又是食品,在我国古往今来一直被广泛用作食品着色剂、调味剂、红腐乳制造原料、肉类保存剂和药物。在我国红曲的生产主要分布在福建、浙江、台湾等省及北京市。其中以福建古田红曲最为著名。红曲应用广泛,最先用于酿造黄酒。后来在腐乳、食醋、食品色素及中药上均有广泛应用。诸如:在著名的茅台酒醪液中,就有数量众多的烟色红曲霉(M.fuliginosus Sato);产于福建、台湾等东南诸省的名酒“红老酒”,也是用红曲酿制而成。此类应用不胜枚举。

我国利用红曲菌的历史久矣,从汉代起就应用它制曲,汉末王粲诗赋“七释”中有“西旅游梁,御宿素粲,瓜州红曲掺揉相半,较滑膏润,入口流散。”的记载,证明当时已有红曲并用它作红饭或腐乳了[12]。据查证,红曲的食用记载,最早见于五代陶谷撰写的《清异录》之“酒骨糟”条:“孟蜀尚食掌食典一百卷,有赐绯羊,其法:以红曲煮肉,紧卷,石镇,深入酒骨腌透,切如纸薄,乃进(注:酒骨,糟也)”[9]。宋胡佰的《苕溪渔隐丛语》有“江南人家造红酒,色味两绝”[8]。李之仪的《姑溪居士集》中有“红糟笋”之描述[9];苏东坡的诗中有“剩余故人寻土物,腊糟红曲寄鸵蹄”;苏轼的诗词中有“夜倾闽酒赤如丹”“有兴欲倾红曲酒”的诗句[23,30];南宋阮阅亦有“尽沽江酒夕阳归”(江,即江西)等赞美诗句[31]。这表明当时民间已经较为普遍地制造红曲了。红曲的药用记载,最早当数元代吴瑞撰写的《日用本草》(1329年) [8,9]一书:“红曲酿酒,破血行药势,杀山岚瘴气,治打扑伤损。”而一般多将红曲的最早药用记载归于忽思慧撰写的《饮膳正要》(1330年) [11,32]:“味甘、平、无毒,健脾,益气,温中,腌鱼肉用”,这似有不妥。元代韩奕《易牙遗意》有用红曲制作“大熬肉”的记载;鲁明善《农桑衣食撮要》尚有用红曲酿醋的记载[9,12];至明、清两代已有大量记载,李时珍的《本草纲目·谷部第二十五卷》(1578年)丹溪补遗[1]曰:“红曲,法出近世,亦奇术也”。吴仪洛的《本草从新》[33]曰:红曲以白米饭杂曲母,湿热蒸罨,……红入米心”。《本草求原》曰:“粳米饭加酒曲窖,变为真红”。清代的《本经逢源》、缪希雍的《本草经疏》、《得配本草》、《要药方剂》《本草衍义补遗》、汪昂的《本草备要》及《医林纂要》中亦都有对红曲的记载和论述[22];如清代牛彝尊《食宪鸿秘》有用红曲制作香糟的配方和用法;李化楠《醒图录》记载了极酸醋法;曾懿《中馈录》记载了制腐法;顾仲《养小录》有酒发鱼制法[9]。我国台湾的红曲相传是前清时代郑成功收复台湾后由福建至台的制酒匠人引入的[8];据日本田中静一的《中国食品事典》:“日本红曲系从中国传入”[7]。可见,我国人民认识和利用红曲至少已有1000多年的历史,发明红曲的年代应从汉代算起,日本的花井四郎先生就认同这一观点,并在其著作《黄土に生まれた酒》中引用[23]。

红曲也被称作“丹曲”。明代宋应星《天工开物》记载了它的制作和用法,即精白米浸渍水中7天后蒸,以红酒精为种曲加工,在瓦室连续培养约1周可得。在我国台湾东南诸省,至今仍沿用红曲保存食物的做法:“狱讼日繁,酒流生祸,其源则何幸!祀天追远。沉呤《茼颂》:《周雅》之间,若作酒醴之资曲蘖也,殆圣作而明述矣。”“惟是五谷菁华变幻。得水而凝,感风而化。供用岐黄者神其名,而坚固食羞者丹其色”[8]。

明、清两代的本草学者著作梁充栋,著名如李时珍《本草纲目》、汪昂的《本草备要》、吴仪洛的《本草从新》、缪希雍的《本草经疏》、张璐的《本经逢源》等,都有关于红曲的较全面记载。红曲味甘性温,李时珍称其与神曲相同。汪昂论红曲,也认为“人营而破血,燥胃消食,活血和胃”。《本草纲目》还记载有古筹划《摘玄方》用红曲与香附,乳香等分为末、酒服,治腹痛。虽未说明是何种心腹痛,但从方中3味药和用酒服等,可知是气血阻滞所致。由此可见,红曲有活血和营、消食除滞之功。

红曲作为一种食疗兼备的重要中药,一直倍受我国人民的珍爱。迄今在《中华人民共和国药典》和北京、湖南、山东、内蒙古等省市的地方中药材标准及炮制规范中,仍记载有红曲,内容几乎与古藉文献中一致。


3红曲的现代研究

传统意义上的红曲在亚洲国家,红曲霉在粮食上发酵而成的产品(称为红曲)作为一种传统的发酵食品,在酿酒和食品上的应用已具有相当长的历史。但普通红曲中绝大部分不含Monacolin类物质,这与其用途有关。这种固体发酵是以积累红曲菌体量为目的,而不产红曲次生代谢物Moncolin类化合物。红曲固体发酵法生产红曲次生代谢产物Monacolin类化合物是一种创新Monacolin类化合物的代谢调控主要与红曲生物量积累到一定程度之后进行的次生代谢有关。次生代谢受多种因素的影响,目前其调控机制尚不清楚。传统的生产普通红曲的固体发酵技术很难生产出质量稳定含Monacolin的红曲。用固体发酵技术生产丝状真菌次生代谢产物的此前没有先例。调脂红曲的研究其核心内容和技术关键就是采用全新控制微生物次生代谢的固态发酵技术生产具有竞争力的红曲次生代谢产物Monacolin类化合物,其难度远高于以生物量积累为目的的传统发酵技术。日本、韩国等亚洲国家和台湾地区在上个世纪80年代末期开始进行固态发酵法产含Monacolin类物质的红曲的研究和开发,目前上述地区从有限的公开发表的资料和已上市的产品看,其固体发酵技术水平低于4mg/g(Monacolin K含量)。

我国在这方面的研究也始于上世纪80年代末期,地奥制药公司第一个推出了有Monacolin的红曲为单味成份的调脂新药—脂必妥片。地奥脂必妥的主要成分是天然降脂红曲。天然降脂红曲具有一些突出的特点,特别是与单纯的Lovastatin相比,含相同Lovastatin剂量情况下红曲具有更强的降脂综合疗效,并降低了长期服用他汀类降脂药物而可能产生的毒副作用,其效价比较符合我国的国情。随后北大维信又开发出了以含有Monacolin化合物的红曲抽提物为主要成分的药物—血脂康胶囊。在早期红曲固体发酵产Monacolin类化合物的技术水平不高,Monacolin含量较低,为了保证疗效,采用较大的服用剂量或是在发酵后处理工艺中用有机溶剂抽提浓缩的方法来提高含量。对于后者,目前国际上流行的一种看法是:全天然的产品在后处理的加工过程中只能有物理的加工过程,如干燥,粉碎等,而不应有任何的有机溶剂处理过程。这是因为有机溶剂的提取浓缩过程中,是否会有其中的某些成分发生化学变化而产生有害物质及有机溶剂的残留等。我们与德国、法国、日本等国家合作,经过长期的研究,近年来在采用固体发酵技术生产高含量的Monacolin类化合物的红曲中取得重大突破,工业化生产规模中红曲MonacolinK开、闭环结构总量最高可达18mg/g,其固体发酵水平已超过国外水平,处于国际领先水平。


4红曲的化学成分

4.1 酶类  

主要有糊精化酶、α-淀粉酶、淀粉1-4葡萄糖苷酶、麦芽糖酶、蛋白酶、羧肽酶等,其中,红曲霉葡萄糖淀粉酶有5种类型,分别为:E1、E2、E3、E4和E5,主要成分为E3和E4[6,11,13]。宋洪涛等采用福林-酚试剂比色法和次碘酸法进行蛋白酶活性及淀粉酶活力的测定,发现不同产地红曲中均含有蛋白酶和淀粉酶,但含量差异较大,认为采用蛋白酶和淀粉酶作为衡量红曲发酵的内在质量指标及判断工艺的合理性是可行的。邢旺兴等采用采用凝胶电泳法分析了7种不同种红曲霉的胞内和胞外酯酶同工酶,模糊聚类法分析供试菌间的亲缘关系,发现胞内酯酶同工酶明显多于胞外酯酶同工酶,种间存在明显差异。


4.2 色素

从红曲中提取获得的红曲色素,是我国传统的食用红色色素之一,也是我国特有的产品。我国现有红曲生产厂家有上百家之多,分布于福建、江西、广东、浙江、北京、上海、江苏、宁夏等省、市和自治区,年产量可达8000多吨。其中大多数用于腐乳生产及其它食品和药用,此外还远销国外。八十年代初,国家为加强对其生产的管理,组织有关单位开展了红曲生产工艺、质量监控和食用安全性等多项调查研究,最后制定了食用红曲米的国家标准GB4926-85。

已分离得到潘红(rubropunctatin)、梦那玉红(mona-scorubrin)等2种红色色素;梦那红(monascin)、安卡黄素(ankaflalvin)等2种黄色色素;潘红胺(rubropunctamine)、梦那天红胺(monascorubramine)等2种紫色色素[10];还有2种黄色素“Yellow II”和“Xanthmonascin A”,但尚未命名,结构式待定,它们的分子式为C25H31NO5、C23H27NO5[14]。

红曲色素的急性毒性试验表明:小白鼠经口实验无毒性,即使给予实验可能的最大剂量20 g/kg,也无死亡。动物亚急性毒性实验、致突变和致畸实验也未发现异常。我国生产红曲米主要是用M.anka Sato菌株。至今未发现对生产及食用者产生不良作用,也从未分离出致癌性物质。因此红曲色素在限制使用量的条件下,作为食品着色剂是安全的。

第二次世界大战后,由于发现化学合成色素的使用安全性存在问题,国际上开始进行天然红曲色素的研究和利用。近几年欧美等国,对红曲色素的研究也引起了普遍关注。

七十年代以来,人们对红曲色素的代谢机制开展了一系列的研究,基本上摸清了某些色素生化反应途径,尤其是橙色素。日本学者远藤章等还提出,Monascus属菌代谢产生色素的途径,可能与它们代谢产生药理活性物质Monacolin K的途迳,有一段相同的生化合成过程。

有关红曲色素的制造,我国仍以传统的固体发酵法为主,液体发酵方面虽有报道,但是由于液体法生产得到的产品其色价水平和产量远低于固体的方法,因而限制了它的发展。造成这两种方法差异悬殊的原因,至今也还是一个尚未解开的谜。


4.3 Monacolin类化合物

1979年,日本学者远藤章从Monascus属的一种M.ruber培养液中发现5种莫纳可林成分均有抑制胆固醇合成的作用。其中以莫纳可林K(Monacolin K)功效最佳。其商品名又称Lovastatin(洛伐他丁)。80年代,日本人Negishi等对红曲霉属18个菌种1个亚种共124菌株进行筛选,从M. ruber,M. purpureus,M. pilosus,M. vitreus和M. Pubigerus 5个红曲霉属菌种中,得到了强效降血脂成分Monacolin K。接下去又分别得到了Monacolin J、L、X、M,Dihydromevinolin及Dihydromonacolin L.等降血脂成分[15]。我们从由紫红曲霉诱变菌株M. purpureus MS18接种于大米发酵制备的红曲药材中分离得到无色针晶化合物,经鉴定确证为洛伐他汀,收率0.0022%[30],并建立了红曲药材中洛伐他汀的HPLC定量分析方法,发现不同产地商品红曲中所含的洛伐他汀差异很大。


4.4高产Lovastatin菌株筛选

已有不少人进行了高产Lovastatin的红曲霉菌筛选研究,如路秀玲通过测定发酵物中氨基葡糖含量和底物干重减重的方法研究了固态发酵红曲霉生长状况,发现利于产物大量生成的变温发酵中有二次生长高峰出现。并以此为理论基础采用单因素及Box-behnken实验设计,利用SAS软件优化,并确定了红曲霉固态发酵工艺,即以大米为培养基,初始含水量为50%,并使其保持在46%~52%范围内,初始pH6.0,基质厚度3~4cm,30℃培养9天后降至25℃培养到13天,Monacolin K的最高产量达5.34mg/g干固物。莫海涛使用扫描电镜发现了固态发酵红曲霉的类似二次生长过程。张军(中国专利99110881)采用一株高产洛伐他汀的红曲霉菌经红曲霉斜面纯种培养、红曲霉液体摇瓶种子培养、红曲霉种子罐培养后再经液体深层发酵及物理处理的工艺,与现有的曲盘通风制曲或液体种子固体曲制成的红曲米等方法相比,除具有红曲米与红曲霉菌体差别以外,还保证了所制得的红曲霉菌体粉中含洛伐他汀比红曲米高。王立新(中国专利97100245)发明了一种红曲霉固态发酵方法和设备,可缩短以生产洛伐他汀为目的红曲霉发酵时间,提高其发酵产物的产量和质量。丁前胜(中国专利1059463)发明一种新菌株紫色红曲菌N4 M. purpurus(AS3.4691)、红曲菌N14  M. anka(AS3.4692),具有代谢产物效率高,发酵产生的红曲色素、生物降脂素等功能多等特点,可开发多种保健食品(药品),对TG降率可达30-60%。诸葛健(中国专利01104382)发明了一株由酒曲中分离到的并经诱变筛选获得的高产株红曲霉白色变种3001-18(M..var.white3001-18;CGMCC0517)该方法所得制品的洛伐他汀含量高达15-20mg/g。樊游从110个不同样品中分离得到23株红曲霉菌,并收集到18株红曲霉菌,基本上属于6个类群:安卡红曲霉类、高梁红曲霉类、紫色红曲霉类、红色红曲霉类、蛛网状红曲霉类、烟色红曲霉类。对所有41株红曲霉菌进行固态发酵,经HPLC法检测,筛选到3株能产Monacolin K。选择27#做Co60诱变,得到50株突变株。从中筛选到一株27-5突变株,Monacolin K的产量比原株提高12倍,达到192μg/g。


4.5 其它 

红曲霉素的发酵产物中尚含有:麦角甾醇、乙醇、硬脂酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、草酸、醋酸、核苷酵素,微量的乙醛、蚁酸、杂醇油、丙酮、3-羟基丁酮等[10,11,13,16,17]。


4.6 红曲毒性成分—Citrinin

肾脏是Citrinin作用的靶器官,Citrinin也被称为肾毒素(nephrotoxin)。能抑制肾皮质和肝线粒体中的浕-酮戊二酸和丙酮酸脱氢酶的活性,从而降低线粒体对钙离子的吸收,影响膜转移和氧化还原系统。Citrinin同时有致畸性。对其他器官和细胞的毒性及机理目前正在进一步深入研究中。1979年香港中文大学Hin-ChungWang等人从红曲产品和发酵液中分离出一种对革兰氏阳性菌具有抗性作用的化合物并命名为Monascidin A(红曲杀菌物A)。1995年Blanc等人从红曲的发酵产物中分离出了Monascodin A,并从结构上证明MonascidinA就是Citrinin。已有的研究结果都支持这种结论。Blanc等人的发现发表之后,国际上对红曲产品安全性产生怀疑。美国FDA对红曲色素的安全性评价中特别要求对cirtinin进行评价。在日本红曲生产企业推动下,日本厚生省于1999年版的“日本食品添加剂标准”中规定了红曲中的Citrinin限制剂量为0.2μg/g(200ppb),这一剂量是当时能够检出的最低剂量。德国的研究机构曾检测到某些批次的Simvastatin存在Citrinin。这是一种普遍现象还是个别问题,还需作进一步的研究。但从Lovastatin、Simvastatin和Provastatin等他汀类降药物都是来源于Aspergillus terreus或Penicillium液体发酵,而Aspergillus和Penicillium正是产Citrinin能力最强的丝状真菌。这3种他汀类药物都有存在Citrinin的可能。鉴于红曲和其他微生物来源的他汀类降脂药物中存在Citrinin的可能,而降脂类药物是需要长期服用的药物,因此其安全性尤为重要,建议应在红曲和其他微生物来源的降脂药物中尽快建立严格的Citrinin控制标准,保障这类降脂药物的用药安全。


5成分分析

5.1 定性分析

5.1.1生理学特性试验 

邢旺兴等以土曲霉为对照,对常见几种用于发酵制备红曲用的红曲霉进行了9种氮源、13种碳源利用及明胶水解等生理学特性试验。结果所有红曲霉均能利用大豆粉等有机态氮,对硫酸铵等无机态氮的利用则有明显差异;大多数红曲霉均能利用大部分糖类,但均不利用乳糖醛酸,对棉子糖、乳糖、鼠李糖及山梨糖等少数糖类的利用表现出明显差异;变红红曲霉和紫红曲霉能使明胶水解,其余则不能水解明胶。认为氮源、碳源利用及明胶水解反应作为对红曲霉分类的生化指标,具有一定的价值。


5.1.2形态学特性试验

邢旺兴等研究了7种常见红曲的形态学特征,以几种常见红曲霉标准株为基原菌,采用纯化菌种法制备红曲,并进行性状鉴定、粉未鉴别等研究。结果不同红曲之间的性状及菌丝、分生孢子、闭囊壳和子囊孢子等形态学特征存在一定的差异。


5.1.3显微特性试验  

7种红曲生药的基本性状为米粒状,大小1~2×6~7μm,完整或破碎;外表红色、紫红色或褚红色,内部粉红色、红色或紫红色,质脆,粉性,味淡。整体在低倍镜下观察,表面基本平整,具颗粒或残有菌丝;用解剖刀剖开,断面淡红色至紫红色,具光泽。不同种红曲的形状大小、质地和气味较为相似,主要区别特征为色泽和断面特征。根据各种红曲粉末的显微鉴别发现,各种红曲粉末均为淡红色至紫红色的不规则块状物,根据菌丝、油滴、分生孢子、闭囊壳及子囊孢子等显微特征,可对红曲进行区分和鉴别。


5.1.4超显微特性试验 

邢旺兴等研究7种红曲霉的超显微特征,玻片法培养7种常见制备红曲用红曲霉标准株,预处理后进行扫描电镜的观察和比较。取红曲霉菌已培养10d的载片培养物,将粘有菌丝的盖玻片轻轻揭下,然后在2.5%戊二醛溶液中固定12h,用pH7.2 的0.1mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3次,转入1%锇酸溶液中固定1h,再用上述缓冲液漂洗3次,经50%、70%、90%和100%乙醇梯度脱水,置醋酸异戊酯中20min,取出,临界点干燥。用Eiko IB-3型离子溅射仪喷金后置HIACHI S-520扫描电镜下(20KV)进行观察。几种红曲霉菌的菌丝直径2~8μm,具横隔,分枝,含有空泡及油滴。分生孢子梗由菌丝生出,在其顶部产生分生孢子,单生或2~10个成链,大多为梨形,少数为卵球形4~12μm。闭囊壳球形,直径25~75μm,具柄,闭囊壳内散生众多子囊,成熟后子囊壁解体,孢子剩留在薄壁的子囊壳内。子囊孢子卵形或椭球形,2~7.5μm。不同种红曲霉之间在菌丝、分生孢子、闭囊壳和子囊孢子等超显微特征方面存在一定的差异,据此可对红曲霉进行区分和鉴别,为该属真菌的分类提供依据并为中药红曲的生药鉴定提供佐证。


5.1.5紫外光谱分析(UV)

邢旺兴等应用UV对国内常见的7种红曲霉制备而成的中药红曲进行鉴别研究。结果不同种红曲霉制备的红曲的紫外光谱及其导数光谱存在明显差异,可作为红曲药材的质量评价手段之一。


5.1.6差热分析(DTC)

邢旺兴等将不同红曲霉菌种发酵的红曲米和粳米于60℃烘干,粉碎,过100目筛,各取0.5g待测。使用CDR-1型差热分析仪,量程±50mV,升温速率20℃/min,温度范围60~650℃,气氛为静态空气,参比物为空铝坩锅。每次取2mg的样品粉末,置于铝坩锅中,对7种红曲进行差热图谱扫描,获得一系列热谱特征曲线,几种红曲的差热分析谱可见吸收峰值温度范围为355.0~363.7℃。据此可将几种红曲大致分为2类,是一种方便实用的物理鉴别方法。


5.1.7近红外漫反射光谱法(NIRDRS)

邢旺兴等用NIRDRS结合聚类分析鉴别中药红曲。测定方式:积分球漫反射,扫描范围:4050~7500 cm-1,分辨率:4cm-1,扫描次数:64次,光谱处理21点平滑后求一阶导数、25点平滑后求二阶导数,用OPUS/INDENT定性分析软件,进行聚类分析。将18个不同产地红曲样品与7种不同种红曲霉标准株发酵制备的红曲药材共同聚类,橙色红曲(M. aurantiacus Lee)首先与红色红曲(M.ruber van Tieghem)聚成一类,再依次与巴克红曲(M.barkeri Dangerd)、紫色红曲聚成一类,因为它们产生的色素相近。变红红曲(M.serorubesceus Sato)和烟色红曲(M.fuliginosus Sato)自聚一类,再与上述4种颜色较近的红曲聚为一类;它们都与发白红曲(M.albidus Sato)的距离较远。可以有效地鉴别不同产地和不同种的红曲,是一种快速、简便、低耗的新型分析技术。


5.1.8薄层色谱法(TLC)

邢旺兴等应用TLC法对国内常见的7种红曲霉制备而成的中药红曲进行了鉴别研究。采用双展开系统,即在展开剂A为乙醚∶正己烷∶甲酸(50∶50∶0 5,v/v/v)及展开剂B为乙醚∶氯仿∶正己烷∶甲酸(25∶17∶58∶0 5,v/v/v/v)中展开;结果不同种红曲霉制备的红曲的薄层色谱行为存在明显差异,TLC法可作为红曲药材的质量评价手段之一。在此基础上建立了红曲生药的薄层层析鉴别方法,取红曲样品适量,于60℃烘干24h,粉碎过60目筛,精密称定10g,置索氏提取器中用无水乙醇回流提取6h,提取液浓缩成浸膏样,用硅胶H2g拌样,60℃烘干12h,上硅胶H层析柱,以石油醚 乙酸乙酯(1∶1)低压洗脱,收集洗脱液,至第一条红色色素带即将洗出或在以下展开系统中斑点Rf值约等于0为止。浓缩近干,用适量无水乙醇溶解,过滤,滤液置于1ml容量瓶内,加无水乙醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液,吸取该液,在硅胶H 0.5%CMC Na薄层板上点样50μl,同时点以0.5mg/ml洛伐他汀氯仿溶液20μl作对照,以正己烷∶乙酸乙酯∶乙醚∶甲酸(10∶8∶2∶0.1)展开3次,展距15cm,展毕取出薄层板,晾干后,喷以5%磷钼酸乙醇溶液,105℃烘10min,供试品色谱中,至少应有9个蓝色斑点,在与洛伐他汀对照品色谱相应的位置上,应显示相同的蓝色斑点。


5.1.9气相色谱法(GC) 

邢旺兴等采用GC建立了中药红曲基原菌中挥发性成分的气相色谱分析法。色谱条件为进样口温度280℃,检测器温度280℃,程序升温条件:130℃,5min→10℃·min-1→200℃,10min,FID检测。结果不同种红曲霉挥发性成分、非挥发性成分和含量均存在显著差异,根据红曲霉挥发性成分或非挥发性成分指纹图谱的主要峰及其相对含量,可以有效地鉴别红曲霉属真菌。毛细管气相色谱法模糊聚类分析对鉴别红曲霉属真菌具有一定的实用价值。


5.1.10高效毛细管电泳法(HPCE)

邢旺兴等采用HPCE建立了一种中药红曲基原真菌新的鉴定方法。采用毛细管区带电泳(CZE)分离模式,背景电解质为20mmol/L硼酸盐缓冲液(pH9.11),电压20kV,温度25℃;紫外检测波长214nm,压差进样,进样时间5s。结果不同种红曲霉胞内和胞外水溶性蛋白质的成分和含量均存在显著差异。根据红曲霉胞内或胞外水溶性蛋白质4~10min区间内的指纹图谱及这些峰的相对含量,可以有效地鉴别红曲霉属真菌,结果与形态学以及扫描电镜的检验结果一致。


5.1.11凝胶电泳分析(IEF) 

宋洪涛对从各地红曲药材样品中分离纯化到的12株红曲霉属真菌(MS01~12号)及MS18号菌株进行可溶性蛋白、酯酶和超氧化物歧化酶(SOD)的凝胶电泳分析,研究不同产地红曲中可溶性蛋白和2种同工酶的凝胶电泳所反映的亲缘关系,认为MS01~12号菌株为同1个种,而MS18号菌株是不同种或是它们的1个变种。


5.1.12随机扩增多态性DNA技术(RAPD) 

邢旺兴等建立中药红曲基原菌的RAPD分析方法。以CTAB法提取紫色红曲霉等7种红曲霉和1株土曲霉的基因组DNA;溴化乙啶荧光强度和分光光度双重测定法确定DNA浓度;琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物,PHYLIP3.5c进行聚类分析。结果从60个随机引物中筛选出S282等10个引物的扩增产物谱带多,特征好;红曲霉属种间指纹图谱差异较大,呈现出明显的DNA扩增产物多态性,该技术可作为真菌系统分类的客观而有效的手段之一。并进一步应用于不同产地红曲基原真菌分析。结果RAPD扩增产物谱带多,特征好;产地间指纹图谱呈现出明显的DNA扩增产物多态性,可作为红曲鉴定的有用手段。


5.2定量分析

5.2.1超临界流体萃取(SFE) 

张骊等将超临界CO2流体技术用于红曲中胆固醇抑制物的提取,获得较佳萃提条件如下:温度55℃,压力22MPa,时间15min,粒度(D)2mm同时,根据实验判断,可能有超临界流体的细胞破壁作用存在。


5.2.2高效液相色谱测定法(HPLC) 

唐根源建立了红曲中洛伐他汀的HPLC法,色谱柱:Supelcosil LC-18-DB,4.6×250mm,流动相为甲醇:水(80:20,V/V);检测波长:237nm,流速:1.0mL/min。洛伐他汀相关系数为0.9997,RSD为0.88%-1.13%;王春娜也以此法检测了功能红曲中的洛伐他汀。张世轩等用HPLC分离测定功能红曲中的洛伐他汀的含量,选用Spherisorb ODS柱,以甲醇-0.1%磷酸(75:25,V/V),检测波长237nm。该方法具有良好的线性关系和分离度,重现性好,平均回收率为100.43%,RSD为1.82%,应用于功能红曲样品测定,最高洛伐他汀含量为238.21μg/g。宋洪涛等采用硅胶术预处理-HPLC对自制红曲H-18及市售红曲中洛伐他汀进行了定量分析,选用Nova-pak C18(4.6mm×250m,6μm)柱,以甲醇-0.1%磷酸溶液-乙腈(60:30:10)分离测定红曲中的洛伐他汀,检测波长237nm,流速:1.2mL/min,该方法具有良好的线性关系和分离度,重现性好。结果不同产地商品药材中有7种未测出或只有痕量,5种含量甚微,自制红曲H-18含量最高,达5 μg/g生药。


5.2.3微量元素分析 

林培英等应用火焰原子吸收光谱法测定了红曲中Cu、Zn、Fe、Mn、Mg、Ca等微量元素的含量,以SPSS10.0统计分析软件进行聚类分析。不同产地红曲中Cu、Fe、Mg、Ca等微量元素的含量有显著性差异,而Zn、Mn的含量无显著性差异,不同种红曲霉对微量元素的含量影响较产地和工艺等因素的影响要小。


5.2.4薄层扫描法(TLCS) 

徐艳春等用薄层扫描法测定了红曲及其制剂血脂康中大豆苷元的含量测定方法。结果大豆苷元在0.1-0.5μg线性关系良好,平均回收率98.7%,RSD 5.00%。宋洪涛等用薄层扫描法测定了血脂平胶囊中洛伐他汀的含量。


5.2.5氨基酸分析 

宋洪涛等们对9个不同产地红曲采用氨基酸自动分析仪进行氨基酸的分析,采用气相色谱仪进行脂肪酸的分析,结果9个不同产地红曲中含有19种氨基酸,其中有10种药用氨基酸(48%-63%)、7种人体必需氨基酸(29%-45%),游离氨基酸的含量(0.81%-1.14%)约为其发酵培养基梗米的15-21倍。国内8个不同产地红曲中含有多烯不饱和脂肪酸约为总脂肪酸的(16%-27%)、新红曲H18中多烯不饱和脂肪酸约为总脂肪酸的48%。


5.2.6红曲多糖分析 

南京大学田军等进行了红曲多糖的化学结构分析,用从酒曲中分离得到的紫红曲霉935菌株(南大935)提取分离红曲粗多糖,并用葡聚糖凝胶SephadexG-200进行纯化获红曲多糖纯品。发现红曲中存在大量的红曲多糖。通过硅胶薄层层析和气相色谱、红外光谱,核磁共振氢谱等色谱与光谱技术基本确定了红曲多糖的结构组成。红曲多糖是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,分子量约为40万,其摩尔比为1∶2∶4,该多糖分子中是以1→3位糖苷键为主,同时亦含有1→6和1→2位糖苷键。红曲多糖纯品呈白色,粉末状,易溶于水,水溶液粘稠,pH6,无臭无味。不溶于高浓度乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。1%的红曲多糖溶液粘度为500cp,比旋光度为[α]22D=1.72,蒽酮试剂反应呈蓝绿色,苯酚 硫酸反应呈桔红色,α-萘酚试剂反应呈紫红色。应向贤建立了红曲霉菌M-34的深层培养工艺和红曲霉胞壁多糖的提取纯化工艺:多糖提取液→Seveg法去蛋白→乙醚脱脂 →SephadexG-25脱盐→DEAE-纤维素离子交换柱组分分离以及脱色→Sephadex G-100凝胶柱分级分离→真空浓缩→冷冻干燥。DEAE-CeLLuLose离子交换柱分离得到3个组分,其中的组 分Ⅰ经ISephadexG-100分级分离又分为SG-1和SG-2两个组分。组分SG-2的红外光谱和核磁共振谱表明,该多糖是一种以β-1,3-糖苷键构成主链,并含有侧链和多种取代基团的杂多糖。


6药理作用

6.1降血脂作用  

远藤章教授发现5种莫纳可林成分均有抑制胆固醇合成的作用。其中以Lovastatin功效最佳,对大鼠体内胆固醇合成,ED50为0.046mg/kg。以8mg/kg剂量给犬服用,5天后血浆胆固醇浓度降低14.1%,12天后降低24.2%,21天后降低29.3%。其中主要是LDL-CH的降低,LDL/HDL比率下降约50%。其对血清胆固醇降低作用显著,并有降低甘油三酯及低密度脂蛋白的作用[18]。与其它降血脂药比较,Lovastatin的降脂效果优于氯贝丁酯、考来烯胺、普罗布考、烟酸等[19],能有效地防治动脉硬化、冠心病、脑血栓等疾病。国内对红曲的降脂活性研究也较多,并有众多相关专利,如李伯刚(中国专利95111224)发明了包括50~100%的红曲粉和0~50%的辅料组成的用于治疗高脂血症的脂必妥药剂,是一种疗效确切、安全无毒的纯天然降脂药,可制成片剂、胶囊、散剂和冲剂。北京大学的张茂良(中国专利93100737)首次在传统红曲制备中培养出高含量降脂成分Lovastatin。并进一步用该新培育的红曲制成一种既降低血脂又能降低胆固醇的红曲制剂血脂康(中国专利96119835),可用于治疗高血脂症及相关心脑血管疾病。张茂良(中国专利97116744)发明涉及19个红曲菌菌种以及用其发酵制备的红曲制成胶囊剂或片剂。既能降低血脂又可降低血清总胆固醇的中药,也可用于治疗与高脂血症相关的其它心脑血管疾病。朱建中(中国专利97112548)发明了由红曲菌种、麦芽汁、豆饼粉或黄豆粉等为原料采用微生物发酵制得的一种理想的降压降脂降血糖红曲药物,疗效可靠,无副作用。谢申猛(中国专利00107206)利用红曲霉固体发酵方法来进行硒的生物转化,得到有机硒为主要硒形态的富硒红曲,具有更显著的降脂降糖抗氧化作用。毛宇等(中国专利02113797)以三七或三七提取物与红曲或红曲提取物(10%~90%:90%~10%)的组合物为原料,制成片剂、胶囊剂等,能有效、安全的预防或治疗心脑血管疾病。我们以高脂血症鹌鹑模型研究了市售红曲H-04和利用现代生物技术自制的新红曲H-18的血脂调节作用。结果显示二者均具有明显降低高脂血症鹌鹑血清TC、TG、LDL-CH的作用;红曲H-18各剂量组对TG、LDL-CH的降低作用大于红曲H-04相应剂量组,但统计学上无显著性差异;红曲H-18高剂量组和红曲H-04高剂量组对TC的降低作用有显著性差异(P<0.05)。提示红曲H-18比红曲H-04具有更强的降血脂活性。高脂家兔、鹌鹑模型的药理学试验表明,血脂康对内源性高胆固醇血症,有显著降低血清TC浓度和升高HDL-C的作用,显著降低动脉粥样硬化指数(TC/HDL-C)(P<0.05);对外源性高脂血症组,家兔血清TC、TG浓度和动脉粥样硬化指数明显降低(P<0.05),且有抑制主动脉粥样硬化斑块形成和脂质在肝脏沉积的作用。通过对动物模型进行的相当于临床用药量500倍的急性毒性试验,和相当于临床用药量30、60倍的长期毒性试验,证明它几乎没有毒副作用。经中国医学科学院阜外医院等多单位324例临床疗效观察证明:血脂康可使TC、TG、LDL-C、动脉粥样硬化指数,平均降低23.0%,36.5%,28.5%和34.2%,而平均升高HDL-C 19.6%,临床总显效率为79.7%,总有效率为93.2%。


6.2降糖作用

山内等在进行红曲菌培养物降低血清胆固醇,动物试验的同时,发现所有试验兔子服用后0.5h内血糖降低23%~33%,而在1h后血糖仍比对照组下降19%~29%,其机理有待进一步研究。经中国医学科学院阜外医院、北京医院、北京中医药大学北京东直门医院、哈尔滨医科大学临床药理基地等单位用药8周,324例临床疗效观察证明:血脂康具有疗效确切的降脂作用同时,对于非胰岛素依赖性糖尿病患者也有肯定的疗效。


6.3降压作用

日本国立健康食品研究所在进行饲料添加红曲培养物的动物试验中,发现添加0.2%~0.3%红曲培养物的饲料,可使先天性高血压老鼠血压,由超过26.26Kpa下降至24.0Kpa 以下,其有效成分与降低胆固醇的成份不同,为GABA及Glucosamine或红曲菌的其它细胞壁成分,从M. pilosus IFO4520和M. anka IFO6540的发酵产物中分离得到一分子量<3000的茶色组分[20]。在高血压维持期,黄曲、红曲均有明显降血压作用。尤以红曲为强,不但有很强的抑制作用,还能使血压下降。日本的“八重垣”公司已申请了调节血压“特”字食品,主要原料就是红曲提取物。焦柏忠(中国专利99113192)发明了含菊花、红曲各25-2500份,决明子25-10000份、山楂30-15000份的菊龙饮,是防治心脑血管疾病的降压减肥饮品,具有疗效好、无毒副作用、服用方便、经济负担轻的优点。


6.4治疗局部软组织炎痛

顾家富(中国专利98101780)一种治疗局部软组织炎痛的纯中草药制剂炎痛平膏及其制备方法。主要成分是紫草、白芷、红曲、杜仲等多种中草药。具有软坚散结,通经活络,消肿止痛及杀菌抗病毒的作用。用于治疗肌肉注射引起的局部感染、硬结、急慢性乳腺炎、腮腺炎、软组织创伤后肿痛瘀血,用药1~5次,有效率95%、治愈率90%,对腱鞘囊肿、肱骨外上髁炎、刺上韧带炎、滑囊炎和各种局部痛疼也有较好的疗效。


6.5治疗或预防骨质疏松症

叶文才(中国专利00112033)发明了红曲及其提取物在制备药品或保健品食品中的应用。红曲及其乙酸乙酯提取物预防或治疗病理性或生理性的骨质细胞减少或不足及骨密度降低,并促进和恢复骨质细胞生长的作用,可用于制备治疗或预防骨质疏松症及促进儿童骨骼生长的药品或保健食品。。


6.6舒筋活络

杨孟君以纳米精制壮骨酒清膏120-300份,纳米红曲50-120份等为原料(中国专利01102635),采用微波萃取、减压浓缩、超音速射流技术喷雾干燥等步骤制成了一种纳米壮骨制剂药物,该药物生物利用度高,治疗效果显著。以纳米木瓜35-60份、纳米红曲120-300份等为原料(中国专利01102511)制备成一种纳米舒筋活络制剂药物。以纳米红曲、纳米乌梢蛇、纳米草乌、纳米人参等为原料(中国专利01102148)制备成一种纳米风湿关节制剂药物。以纳米当归、纳米羌活、纳米红曲等为原料(中国专利01102168)制备成一种纳米国公制剂药物。以纳米大黄400-900份,纳米红曲30-60份等为原料(中国专利01102582)制备成一种纳米大黄化瘀制剂药物。


6.7抗肿瘤作用

Maltese等发现红曲霉的发酵产物具有抑制肿瘤生长的时间作用。红曲橙色素Momascorubin及Rubropunctatin具有活泼的羟基,容易与氨基起作用,因此可以治疗胺血症,且可以防治癌症。


6.8抑菌作用

红曲能防止杂菌污染而避免肉和鱼类腐败[27],这方面我国的《饮膳正要》、《天工开物》等历代文献就有记载[1]。但在防腐这一点上,红曲并不能完全替代硝酸盐[22]。据《天工开物》记载:“世间鱼肉最朽腐物,而此物薄施涂抹,能固其于炎暑之中,经历旬月,蛆蝇不敢近,色味不离初,盖奇药也”。1977年,科学工作者Wong HC和Bau YS,首次发现M.Purpureus培养物有抗菌活性,近来文献中又报道了其抗菌活性是由梦那玉红(monascopubrin),潘红胺(rubrop unctamine)二种色素产生的,对芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococus)、假单孢菌属(Pseudmonas)等有抑菌活性,红曲不抑制大肠杆菌(Es cherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bscillussubtil lis)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)等菌[21,22]。另外,有机酸主要是乳酸(占88.6%),还有琥珀酸少量草酸等也有抑菌作用,这一发现与《天工开物》中的记载恰好吻合。


6.9其它

此外对治疗慢性肠炎、痢疾等有一定的疗效。


6.10毒副性

小鼠口服急性实验结果表明,大剂量口服连续14天未发现中毒症状及死亡。LD50大于21 500 mg/kg BW。


6.11 食品功用

红曲中含有葡萄糖淀粉酶能将淀粉几乎百分百之百地水解成葡萄糖,工业上利用红曲霉这一特性代替了酸水解法生产葡萄糖,具有很多优点:水解率高,能节约粮食,降低成本,提高产品质量。我国福建、台湾、浙江等东南沿海诸省一向利用红曲酿制红酒,俗称老酒,闻名于世,红曲还能制醋,制作豆腐乳等乳制品[11]。日本人将鱼仔浸入红曲霉菌发酵液中,用于制备低胆固醇鱼仔[23];食醋中混入红曲霉菌发酵液中作为高血脂病人的食疗用品[24]。由于红曲易培养,产色素能力强,安全性高。国外,特别是日本已广泛用于肉类、鱼、豆、面、糖果酱、果汁等食品着色[25]。另外,红曲也可作头发染料[26]。


7结束语

上述研究表明,内含Lovastatin的新红曲是一个安全有效的中药。它可以治疗高脂血症、动脉粥样硬化引起的冠心病及其它心脑血管疾病。与西药Mevacor相比,综合疗效显著,安全性更高。然而目前我们对红曲的研究还不足以充分解释其独到的综合临床疗效,也正是这一点,吸引着我们更加投入地致力于红曲研究工作。以上,仅就红曲和红曲菌的历史和最新研究动向,结合我们自己的工作做了介绍。令人高兴的是,一千多年前我国人民发明的红曲,现正被越来越多的人们所重视,我们相信,红曲作为食品和药品的一个新领域,将会为人类的健康事业做出更大贡献。


参考文献(略)

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