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天然调脂药物研究进展—脂必妥的研究

作者:天曲生物 日期:2020-10-02 15:12:28 点击数:3

天然调脂药物研究进展—脂必妥的研究

 

    戚天胜

 

(中国科学院成都生物研究所 成都 610041)

 

Research and Development of Red Yeast Rice for lowering cholesterol

 

Zhao hai   Qi tiansheng

 

(Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Science. 610041)

 

Abstract: The discovery of lowering cholesterol function of Red Yeast Rice was introduced and the situation of Monacolin produced from liquid fermentation by strains of Monascus was descript. In liquid fermentation, the amount of Monacolin produced by Monascus was less than that produced by Aspergillus terreus.

Solid state fermentation product of Monascus strains growth on the steamed rice (called red yeast rice) is a Chinese traditional food, which has been used as food color, medicine and ingredient of meat product from ancient time. A new technology was developed to produce Red Yeast Rice content Monacolin, the amount of Monacolin K of Red Yeast Rice manufactured in industrial scale by the new technology was over than 18mg/g and the recovery rate of final product was 55%. A systemic process was established to avoid citrinin production during fermentation process including the quality control of raw material, the usage of Citrinin free strains and contamination control through the manufacture process. The Citrinin of the product is negative or less than 20ppb.The new technology is total adopt to manufacture Chinese medicine ZhiBituo and the productivity is over than 30 ton per mouth. The characteristic of this product including Monacolin K lacton form and acid form and other homologue was introduced and a simple method to distinguish fake product (Red Yeast Rice added Lovastatin) and real product (Red Yeast Rice content Monacolin) was also pointed out.

 

Key word: Red Yeast Rice, Monacolin , Citrinin ,Chinese medicine

 

 

前言

红曲是指红曲霉接种在粮食(如大米)上经固体发酵而成的产品的总称。这种产品作为传统的发酵食品和药品已经有1000多年的使用历史。在我国,目前红曲主要用作酿酒中的发酵制剂和肉制品工业中的发色剂。近年来随着包括从红曲在内的丝状真菌中发现的HMG-CoA还原酶抑制剂Monacolins(他汀类)降脂药物的上市,在亚洲国家开始对固体发酵技术产含HMG-CoA还原酶抑制剂的红曲进行了较为深入的研究。在日本、韩国及我国已经有含HMG-CoA还原酶抑制剂的红曲为主要原料的产品上市,如地奥脂必妥片及胶囊等。天然降脂红曲具有一些突出的特点,特别是与单纯的Lovastatin相比,含相同Lovastatin剂量情况下红曲具有更强的降脂综合疗效,并降低了长期服用他汀类降脂药物而可能产生的毒副作用,其效价比符合我国的国情。对于高脂血症这种需长期服药来控制的代谢性疾病来说,红曲是一种具有较强竞争力而且疗效确切、服用安全的更符合我国国情的天然降脂药物。本文就红曲中HMG-CoA还原酶抑制剂Monacolin类化合物的研究,Monacolin K为主的红曲固体发酵技术,红曲中的降脂成份,红曲的安全性问题,以及天然降脂红曲为主要成份的药物脂必妥片的临床应用进行介绍。

 

一、红曲中HMG-CoA还原酶抑制剂Monacolin类化合物

1.1 Monacolin KLovastatin

1976Endo等用小鼠肝酶系统筛选胆固醇合成抑制剂,从真菌Pythium ultimum 发酵液中筛选出了一种具有抑制作用的化合物,经结构鉴定确认是一种已知的抗生素citrinin由于citrininPencillium citrium 的一种次生代谢产物,Endo又对Pencillium citrium的发酵液进行筛选,发现了三种化合物具有胆固醇合成抑制活性,分别命名为ML-236AML-236BML-236C,其中ML-236B的抑制活性最强。经结构鉴定发现ML-236B是在同年已被Brown等人从Pencillium brevicompactum 发酵液中分离并命名为compactin的一种抗真菌活性的代谢产物。随后Endo等人发现compactin作用的靶酶是胆固醇合成的第一限速酶HMG-CoA还原酶。

1979Endo等人从泰国食品中分离的红曲霉Monascus ruber的发酵液中分离出一种具有更强的胆固醇合成抑制活性的化合物并用红曲的拉丁名Monascus 的字根命名为Monacolin K,但遗憾的是对Monacolin K的结构鉴定中未包含立体化学的工作。一年以后Merck公司的Albert 等人报导了从Aspergillus terreus 发酵液中分离出同一种化合物命名为Mevinolin,在对它的结构鉴定中包括了立体化学结构,并开始进行新药研究,随后merck 公司将mevinolin开发成为第一个他汀类上市新药命名为Lovastatin

由此可知:

1) Monacolin KLovastatin是同一化合物;

2) Monacolin KLovastatin发现的时间早;

3) Monacolin K是红曲霉(Monascus)发酵的产物;

4) Lovastatin是土曲霉(Aspergillus)发酵的产物;

5) Monacolin K是根据红曲霉(Monascus)的拉丁字前缀Mona-而命名,为科学发现的常规命名,无专属性;

6) Lovastatin是由Merck公司所命名,是该公司的专有名称,有专属性。

Endo等人在胆固醇合成抑制筛选上所做的开创性工作被誉为20世纪80年代的生命科学十大重大发现之一,Endo因此而成为诺贝尔生物医学奖的候选人。

 

1.2 红曲中所发现的HMG-CoA还原酶抑制剂的种类及相关菌种(Tab1)

Tab1.  红曲中所发现的Monacolin K 及其同系物

化合物

产生菌

发现者

时间

Monacolin  K

Monascus  ruber

Endo

1979

Monacolin  J

Monascus  ruber

Endo

1985

Monacolin  L

Monascus  ruber

Endo

1985

Monacolin  X

Monascus rubber 突变株

Endo

1985

Monacolin  M

Monascus  ruber

Endo

1986

Dihydromonacolin L

Monascus  ruber突变株

Endo

1985

 

红曲固体发酵样品中Monacolin类化合物的HPLC(Fig.1)


FIG.1.High-performance liquid chromatography (HPLC) for supplement I,(1),Monacolin K analogue;(2),Mona-colin K analogue;(3),Hydroxy-acid form of Monacolin L (compound 5a);(4) Hydroxy-acid form of Monacolin K (compound 1a);(5),Dihydromonacolin K (compound 6a);(6),Monacolin L (compound 5);(7),Hydroxy acid form of dehydromonacolin K (compound 2a);(8)Monacoiln K(compound 1);(9),Methyl ester of hydroxy acid from of mona-colin K (compound 3);(10),Dehydromonacolin K (compound 2).

from: HEBER D, J ALTERNATIVE AND COMPLEMENTARY MEDICINE 2001;7:133

 

Tabl.2  红曲属中不同种产Monacolin类化合物的情况

种名

monacolin菌株数

测试菌株数

M.ruber

9

12

M.pilosus

2

2

M.pubigerus

1

1

M.vitreus

2

2

M.purpureus

3

9

M.anka

6

51

 

红曲属的大多种都具有产Monacolin化合物的能力,红曲是Monacolin类化合物发现最多的微生物。Monacolin类化合物在红曲中具有多样性和普遍性。

 

1.3 红曲液体发酵产Monacolin K 的研究

Monacolin的筛选首先是通过对Monascus的发酵液进行测试来进行的。液体深层发酵(Submerged fermentation)技术是在20世纪40年代随着青霉素的生产而发展完善成熟起来的一门微生物发酵工程技术,液体发酵工程及其相联的以分离纯化浓缩为目的的发酵工程下游技术(downstream)在抗生素及其它微生物来源产物的工业化生产中起着重要作用。目前绝大多数微生物来源的抗生素都是采用这一技术来工业化生产的。Lovastatin以及相当多的Statins类调脂药物均是通过Aspergillus terreus 液体发酵后经有机溶剂萃取浓缩结晶而制成的,其发酵水平已达到2.5mg/ml

目前尚未有关于红曲液体发酵研究的报道。除了技术保密因素外,发酵水平很低是一个主要原因。我们曾研究过红曲液体发酵产Monacolin K的情况,其Monacolin K 的发酵水平低于0.1mg/ml,而且不稳定。台湾也有与我们相似的报道。Blanc等人近年来也对红曲液体发酵产Monacolin K进行研究,其最高水平为0.7mg/ml(私人通讯)。从我们研究结果来看,似乎红曲液体发酵不是产Monacolin K的较适合的方式。这也正是目前为止没有一个他汀类药物或前体是由红曲液体发酵来生产的原因。

 

二、红曲固体发酵产Monacolin类化合物研究

2.1传统意义上的红曲

在我国及周边的亚洲国家,红曲霉在粮食上发酵而成的产品(称为红曲)作为一种传统的发酵食品在酿酒和食品上的应用已具有相当长的历史,在元代的历史文献中其制作方法已有明确的记载。红曲目前主要是在酿酒中作为酶制剂和发酵剂使用,在食品上主要是作为食品的着色剂使用,特别是在肉制品工业上代替硝酸盐作为发色剂使用,用量很大。我国食品添加剂红曲米国家标准GB4926-85中对红曲的定义“红曲霉(Monascus anka Nakazawa et Sato)接种在大米上经培养而制得”。中国药典1990版一部(附录22页)对中药红曲的记载“经真菌紫色红曲霉(Monascus purpureus Went)通过大米发酵而制得”具有“活血化瘀、健胃消食……”功效。这里指的红曲是红曲霉在大米等粮食上培养后而形成的包括红曲霉菌体代谢产物和发酵后剩余粮食的总称。而这种制造工艺即是传统的流行于亚洲地区的固体发酵技术,其原理是将微生物培养在含一定水份的固体状态的营养物质上。

 

2.2普通红曲中的Monacolin类物质的研究

普通红曲中绝大部份不含Monacolin类物质,个别测试样品中仅有少量的Monacolin成份,其含量低于0.05mg/g,这与其用途有关。这类红曲中被利用的主要是酶类和红曲色素等一些与红曲的初级代谢相关的成份。只要红曲霉在固态培养中生长到一定量就会产生相应的淀粉酶、蛋白酶和色素等初级代谢产物,因此这种红曲的固体发酵是以积累红曲菌体量为目的,而不是产红曲次生代谢物。

 

2.3红曲固体发酵法生产红曲次生代谢产物Monacolin类化合物是一种创新

Monacolin类化合物的代谢调控主要与红曲生物量积累到一定程度之后进行的次生代谢有关。次生代谢受多种因素的影响,目前其调控机制尚不清楚。传统的生产普通红曲的固体发酵技术很难生产出质量稳定含Monacolin的红曲。用固体发酵技术生产丝状真菌次生代谢产物在此前没有先例。调脂红曲的研究其核心内容和技术关键就是采用全新控制微生物次生代谢的固态发酵技术生产具有竞争力的红曲次生代谢产物Monacolin类化合物,其难度远高于以生物量积累为目的的传统发酵技术。

 

2.4固态发酵法产红曲中的Monacolin类化合物的研究动态

日本、韩国等亚洲国家和台湾地区在上个世纪80年代末期开始进行固态发酵法产含Monacolin类物质的红曲的研究和开发,日本最大的红曲生产企业“八重墙株式会社” 近年来与Monacolin K的发现者Endo 合作研究开发含Monacolin和其它活性成份的红曲产品。目前上述地区已有调脂红曲的相关产品上市,从有限的公开发表的资料和已上市的产品看,其固体发酵技术水平低于4mg/gMonacolin K含量)。

我国在这方面的研究开始于上世纪80年代末期,1994年地奥制药公司推出了第一个含有Monacolin K的红曲为单味成份的调脂新药——脂必妥片,随后北大维信又开发出了以含有Monacolin化合物的红曲抽提物为主要成份的药物——血脂康胶囊。

在早期的我国红曲固体发酵产Monacolin类化合物的技术水平不高,Monacolin含量较低,为了保证疗效,采用较大的服用剂量或是在发酵后处理工艺中用有机溶剂抽提浓缩的方法来提高含量,保证疗效。对于后者,目前国际上流行的一种看法对其天然性及安全性提出了挑战。这种观点认为:全天然的产品在后处理的加工过程中只能有物理的加工过程,如干燥、粉碎等,而不应有任何的有机溶剂处理过程。这是因为有机溶剂的提取浓缩过程中,是否会有其中的某些成分发生化学变化而产生有害物质,破坏其天然状态,这是一个难以回答但又不能回避的问题。

我们与德国、法国、日本等国家合作,经过长期的研究,近年来在采用固体发酵技术生产高含量的Monacolin类化合物的红曲中取得重大突破,工业化生产规模中红曲Monacolin K开、闭环结构总量最高可达18mg/g其固体发酵水平已超过国外水平,处于国际领先水平。其发酵成本低,质量稳定可靠,加之后处理工艺简单,不需要有机溶剂抽提分离浓缩,与其它来源的他汀类西药相比,使降脂红曲具备了很强的竞争优势。

 

2.5Monacolin含量的红曲固体发酵技术简介

该技术由以下几个部份组成:

①、通过对Monacolin purpureus Went 菌株的筛选驯化,已拥有3个系列的具有稳定的高Monacolin产率且适合于工业化生产的红曲菌种,其中3株不产citrinin

②、研究成功了一套从天然来源的调节红曲Monacolin代谢的刺激物为核心的红曲霉固体发酵技术,其运行经济,可操作性强,各批次发酵含量稳定,Monacolin K总量波动小。

③、建立了与该技术相匹配的发酵后处理技术,保证后处理中Monacolin损失最少,并使产品中Monacolin K开环(acid form)和Monacolin K闭环(lactone form)其比例保持在6:5水平。

该项技术已成功应用于地奥脂必妥片和地奥脂必妥胶囊的主要原料药红曲的生产。

 

2.6关于Monacolin类化合物在固体红曲发酵中的天然状态

Monacolin 类化合物存在所谓的开环结构(acid form)、闭环结构(lactone form)以及闭环结构脱水后的Dehydromonacolin 三种结构形式。这三种结构有如下的互变关系:

Acid form                       Lactone form               Dehydromonacolin

 

Monacolin K开环(acid form)、闭环(lactone form)和脱水后结构变化

HMG-CoA还原酶底物--HMG-CoA的结构

 

只有开环结构与HMG-CoA结构相似(见上图),才能与HMG-CoA还原酶结合形成竞争抑制。闭环结构进入人体之后在肝内经酯酶(羧基酯酶)的催化下可形成开环结构而产生抑制作用。即开环结构是Monacolin(Statins)类调脂药物的活性形式。而Dehydromonacolin则不再具有抑制活性,被称为无效结构,因为与酶结合的部位没有-OH基团。在真菌MonascusAspergillus  Penicillium 的液体和固体发酵过程中,一般情况下Monacolin类化合物是以开环结构为主要的存在方式。这是因为:①开环是一种酸式结构,与闭环相比具有一定的亲水性,更易于透过细胞膜从胞内排到胞外的环境中,有利于减少细胞内产物积累而引起的抑制和毒性;②这几类真菌的发酵条件是一种弱酸环境利于形成开环结构。

由于Aspergillus terreus 液体发酵的后处理工艺是采用有机溶液从发酵液中萃取浓缩结晶,这一过程中开环绝大部分变为闭环,这一过程约有20%-30%的损失,其中一部份是变成无效的Dehydromonacolin

红曲固体发酵的后处理一般是采用温和条件下干燥而成(物理方法),这一过程中有部份开环脱水而形成闭环,其开环与闭环的比例约为6:5。此种情况下Monacolin总量的损失较小。闭环比例越高意味着Monacolin的有效总量损失越大。这是因为开环结构脱水形成内酯的闭环结构过程中存在损失,而且部分闭环结构在此过程中再次脱水产生无疗效的Dehydromonacolin

红曲中Monacolin 化合物的开环与闭环结构存在与否及其二者之间的量比也是一种简便的判断红曲中Monacolin K是人为添加还是自然发酵过程中产生的方法。确实有些厂家用普通食品红曲添加lovastatin(Monacolin K闭环, lactone form)来冒充天然降脂红曲,或是用低含量的降脂红曲人为添加lovastatin后冒充高含量的天然降脂红曲。国外已有报道采用此方法来鉴定天然降脂红曲和由普通红曲人为添加lovastatin假冒的降脂红曲(Fig.2


Figure 2:  HPLC of a pigment containing red rice product mixed with lovastatin

(From: Monascus J, Vol.1,Nr.1,2002)

 

2.7红曲中的主要降脂成分及其与疗效的关系

 Acid form                        Lactone form               Dehydromonacolin

 

Monacolin K开环(acid form)、闭环(lactone form)和脱水后结构变化

 

HMG-CoA还原酶底物--HMG-CoA的结构

 

1) Monacolin K开环结构:

Monacolin K开环结构是红曲产品中特有的成分,它能与HMG-CoA还原酶直接结合而抑制胆固醇在体内的合成,而不需要经过任何在体内的转化过程。

2) Monacolin KLovastatin):

Monacolin K就是Lovastatin,是一种前体药物,即非活性结构(闭环结构),它进入人体之后在酯酶(羧基酯酶)的催化等条件下转化成开环结构才能与靶酶结合而起作用。

3) Monacolin K类的同系物:

红曲发酵的产品中至少存在6种同系物。这些同系物均能与靶酶结合并产生胆固醇合成的抑制活性,这也是天然降脂红曲中具有的独特活性成分。

4) 不饱和脂肪酸:

红曲中脂肪酸约有70%为不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。在对红曲中的不饱和脂肪酸的研究中发现,其碳链的长度从十几个碳到五十几个碳,特别是长链不饱和脂肪酸对降脂作用的影响尤其值得进一步研究。

5) 关于降脂红曲中Lovastatin检测标准:

在降脂红曲产品(如脂必妥)中,一般是以Monacolin开环与闭环之和、Monacolin同系物、不饱和脂肪酸等多种成分来综合评价红曲的降脂活性和疗效。但在国内的药品标准中目前只收订了用LovastatinMonacolin闭环量来检测(并标示)其有效成份(目前国内尚无开环Lovastatin的标准品,故未将其纳入标准中)。以脂必妥中开环量与闭环量之比65为例,标示含Lovastatin (即闭环Monacolin 5mg, 则脂必妥中的Monacolins总量应 >  11mg。另一方面,据Lovastatin的口服生物利用度研究表明,Lovastatin(闭环)在人体内的生物利用度为25% from: Pan HY et al. J Clin Pharmacol 1990;30:1128,该研究同时表明,开环结构比闭环结构的生物利用度高得多,以Lovastatin日用量20mg为例,其生物利用度为5mg。而脂必妥中的Monacolins,开环含量为6.6mg,闭环含量为5.1mg,从理论上讲,其总的生物利用度约为6mg

 

以上研究得出如下结论:

1) Monacolin K开环结构是红曲产品中特有的成分,它能与HMG-CoA还原酶直接结合而抑制胆固醇在体内的合成,而不需要经过任何在体内的转化过程。是红曲主要的有效成分之一。

2) 天然状态下红曲中Monacolin类化合物以开环为主要存在形式。

3) 开环结构在发酵完成之后的干燥处理过程中可部分转化成闭环结构。

4) 标示含Lovastatin 5mg即相当于含Lovastatin Monacolin)总量11mg

5) 加工过程中人为地将天然状态下红曲中开环状态的Monacolin K转变为闭环状态的Lovastatin并无实际意义,因此,这种人为闭环绝无必要。

6) 开闭环存在与否及其量比是判断Monacolin是否是天然发酵而成的方法。

7) 红曲具有调脂作用目前认为主要由四部分组成:即:Monacolin K(Lovastatin)开环结构;Monacolin K(Lovastatin)闭环结构;Monacolin K类的同系物;不饱和脂肪酸。

 

三、红曲中的安全性问题—— Citrinin

 

Structure of Citrinin

 

3.1关于Citrinin 的毒性

Citrinin 是上世纪40年代在Penicillium citrinium 菌中发现的一种真菌毒素,具有肾毒性,肾脏是Citrinin作用的靶器官,Citrinin也被称为肾毒素(nephrotoxin,毒性比较明显,可引起实验动物的肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死,肾小球萎缩等。Citrinin能抑制肾皮质和肝线粒体中的α-酮戊二酸和丙酮酸脱氢酶的活性,从而降低线粒体对钙离子的吸收,影响膜转移和氧化还原系统。Citrinin同时有致畸性。Citrinin对大鼠的LD5067mg/kg,对兔的LD5019mg/kg[1,2]。对其他器官和细胞的毒性及机理目前正在进一步深入研究中。

 

3.2红曲中Citrinin的发现

1979年香港中文大学Hin-Chung Wang等人根据文献报导红曲产品具有防腐保鲜功能,对许多细菌具有抑制作用的启发,从红曲产品和发酵液中分离出一种对革兰氏阳性菌具有抗性作用的化合物并命名为Monascidin A(红曲杀菌物A),但并未进一步对此化合物进行结构鉴定。1995Blanc等人从红曲的发酵产物中分离出了Monascidin A,并从结构上证明Monascidin A就是citrinin。已有的研究结果都支持这种结论:citrinin就是红曲中的抗菌物质,citrinin的抗菌谱和抗菌特性与红曲产品所做的抗菌谱和抗菌特性一致。目前除citrinin外还没有其他的抗菌物质和毒素存在于红曲研究的报道中。

 

3.3国外对红曲中Citrinin的反应

Blanc等人的发现发表之后,国际上对红曲产品安全性产生怀疑。美国FDA对红曲色素的安全性评价中特别要求对citrinin进行评价。在日本红曲生产企业推动下,日本厚生省于1999年版的“日本食品添加剂标准”中规定了红曲中的citrinin限制剂量为0.2μg/g200ppb,这一剂量是当时能够检出的最低剂量。

3.4我们针对降脂红曲中Citrinin所做的工作

1998年以来我们与Blanc进行合作研究如何防止citrinin在降脂红曲中的产生。根据降脂红曲中特点、重点开展了以下的研究工作:

AMonacolin类化合物的红曲中不产citrinin的菌株的筛选:

Blanc实验室对120株菌进行的用citrinin的标准方法进行评价筛选,发现了三株Monascus Purpureus WentMonacolin K的生产菌株具有天然的不产citrinin的能力。这三株菌的发酵产物——含Monacolin K的红曲进行检测表明其citrinin的含量低于20ppb,这一剂量是目前citrinin的检测极限。双方正继续合作拟在现有的工作基础上用产citrinin的和不产citrinin的菌株mRNA差异表达来对红曲中与citrinin合成有关的酶的结构基因和调控基因进行研究,从分子水平上阐明citrinin的代谢机制,从根本上解决红曲菌产生citrinin的问题。

B据固体发酵红曲的特点建立一套严格的污染控制机制,杜绝了发酵过程中因污染而产生citrinin

C原料的真菌污染和citrinin的控制:

对所有的原料进行真菌污染和citrinin检测,杜绝因原料带来的citrinin

3.5微生物来源的他汀类西药中Citrinin的问题

德国的研究机构曾检测到某些批次的simvastatin存在citrinin。这是一种普遍现象还是个别问题,还需作进一步的研究。但从LovastatinSimvastatinProvastatin等他汀类降脂药物都是来源于Aspergillus terreusPenicillium液体发酵,而AspergillusPenicillium正是产citrinin能力最强的丝状真菌。这三种他汀类药物有存在citrinin的可能。

3.6应在降脂药物中建立严格的Citrinin控制标准

鉴于红曲和其他微生物来源的他汀类降脂药物中存在citrinin的可能,而降脂类药物是需要长期服用的药物,因此其安全性尤为重要。我们建议应在红曲和其他微生物来源的降脂药物中尽快建立严格的citrinin控制标准,保障这类降脂药物的用药安全。

脂必妥原料药红曲的化学成分

——————————————————————

                             百分比(%

——————————————————————

蛋白质                         19.4

脂肪酸                          3.5

其中  总饱和脂肪酸           31.1

总不饱和脂肪酸         39.6

总多不饱和脂肪酸       29.3

碳水化合物                     55.3

其中 淀粉                    54.4

Monacolin K

(acid form + lacton form)       0.8

灰份                            4.3

含水量                          4.0

Citrinin                          < 0.15ug/g(150ppb)

————————————————————————

from: Institute of Arotop Food Creation(AFC)  Germany

3.7结论:

脂必妥是安全、有效、价格理想的天然调脂药物。

安全:降脂成分Monacolins日用总量 < 12mgCitrinin含量严格控制;

有效:降脂疗效由多种降脂机理明确的物质协同作用而完成,既增强了疗效又提高了安全性。

价格理想:日用价格 < 2元。使患者不会因经济原因而中断治疗,这对于患者及其心血管疾病的预防和控制是十分必要,也是十分重要的。

 

参考文献

[1] Chagas GM, Cell Biochem Function,1995,13(1):53

[2] Ciegler A,et al.Applied and Environmental Microbiology,1977,33(4):1004, Science,1947,106:291

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