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红曲霉固态发酵产Lovastatin的培养条件研究

作者:天曲生物 日期:2020-10-02 15:14:05 点击数:2

红曲霉固态发酵产Lovastatin的培养条件研究

 

魏培莲1,3   周立平2   岑沛霖1

 

( 1浙江大学生物化工研究所    杭州    310012)

( 2浙江工业大学生物与环境工程学院    杭州    310014

( 3浙江科技学院生物与化学工程系    杭州    310012)

 

摘要:实验菌株Monascus ruber M7固态发酵产Lovastatin的培养条件进行了研究。得出固态基质最佳初始含水量为40%,基础基质中加入葡萄糖和有机氮源能显著提高发酵产物中Lovastatin含量,多种蔬菜浸出汁都能提高Lovastatin产量,红曲米浸泡水对Lovastatin有明显的促进作用。稻米的种类及米的粉碎度对Lovastatin的合成也有一定的影响。在优化的培养条件下,干曲中Lovastatin的含量2.5-3.0mg/g

 

关键词:红曲霉    固态培养   Lovastatin  

Study on the Solid-state Fermentation for Lovastatin

production by Monascus ruber

 

Wei Peilian13    Zhou Liping2    Cen Peilin1

 

1Research Institute  of  Bio-Chemical  Engineering  Zhejiang University     Hangzhou 310012

(2 School of Biological and Environmental  Engineering   Zhejiang University of Technology   Hangzhou     310014)

3Department of Bio-Chemical Engineering  Zhejiang University of Science and Technology  Hangzhou    310012

 

Abstract: The cultivation conditions for solid-state fermentation for producing lovastatin by the object Monascus ruber M7 were studied. The optimal initial water content of substrate was 40%. Steamed rice was used as basic substrate and glucose and organic nitrogen resources should be supplemented to increase the lovastatin productivity. Extract of red-koji and other natural materials such as tomato juice were able to promote the production of lovastatin. The breeds of rice and the particle size of rice affected the production of lovastatin also. At optimized culture conditions, the productivity of lovastatin in dried koji was in the range of 2.5-3.0mg/l.

 

Key words: Monascus ruber     solid-state culture      Lovastatin  

 

 

前言

Lovastatin是胆固醇合成限制酶——3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶AHMG-CoA)还原酶的抑制剂,是目前世界上销售额最大的治疗心血管疾病的药物之一。最初由日本东京农工大学的Endo A[1][2]等从红曲霉属的红色红曲霉(Monascus ruber)培养物中发现,后来证明其他一些微生物,如:土曲霉(Aspergillus terreus)、桔青霉(Penicillium citrinum)、短密青霉(Penicillium brevicompactum)等都能产生Lovastatin或其类似物。

现有关发酵法生产Lovastatin的文献较多[3][4][5],但基本上都采用液体深层发酵工艺。Lovastatin是胞内产物,而且细胞内的积累速率基本上与生长同步,因此非常适合于采用固态发酵的方法。固态发酵具有培养设备和培养工艺简单、培养基价格低廉等优点,如果能够采用固态发酵高效地生产Lovastatin,不仅大大降低生产成本,而且红曲霉的固态发酵产物无须提取,可以直接作为中药服用,减少纯Lovastatin药品的副作用。但是,关于固态发酵法生产Lovastatin的报道甚少。

本文将对笔者所保藏的一株红曲霉固态发酵产Lovastatin的培养条件进行初步研究,考察固态发酵生产Lovastatin的可行性,并对培养条件进行初步优化。

 

1 材料与方法

1.1 菌种

采用本实验室保存的红曲霉Monascus ruber M7菌株。

 

1.2 培养基

种子培养基:粳米粉6%,蛋白胨3%NaNO3 0.2%MgSO4·7H2O 0.1%KH2PO4 0.25pH自然。

固体发酵培养基:以粉碎至10目左右的粳米作为基础培养基,另外加入葡萄糖5%,蛋白胨5%,酵母粉4%

蔬菜浸出汁:称取100g新鲜蔬菜,加入200mL水,煮沸15min2层纱布过滤,收集滤液,冰箱保存备用。

红曲米浸泡水:50g红曲米加入100mL水,60℃的水浴中保温2h2层纱布过滤,滤液备用。

 

1.3 培养方法

液体种子培养:温度30℃;摇床转速200rpm;装液量100mL/500mL三角瓶;种龄为36h

三角瓶固体发酵:调浸米水pH值约4.0,于室温下浸泡过夜。将浸泡过的米充分沥干,然后在121℃蒸米20min,蒸米后补充加入各种营养成分并充分混匀,在每瓶中加入20mL(约相当于40%pH值为4.0的自来水,进行灭菌(氮源和碳源同时加入的时候,氮源和碳源分开灭菌)。灭菌后冷却至室温后进行接种,接种量为10%32℃培养35d,待菌丝布满培养基后扣瓶一次,以后静置在28℃下培养至15d

浅盘固体发酵: 浅盘采用医用搪瓷托盘。将蒸好并与各种营养成分混匀的米装于托盘中,料层厚度控制在1.5cm左右,上盖2层纱布,外用牛皮纸包裹进行灭菌。灭菌后冷却至室温后进行接种,用预先灭菌的玻璃棒搅拌均匀。培养方法同三角瓶固体发酵。

 

1.4 分析方法

含水量的测定:发酵结束后称发酵物的湿重,然后在60℃左右烘干至恒重,称干重,湿重与干重之差与湿重的比值即为含水量,用公式表示为:

含水量=×100%

干物质得率的计算: 

干物质得率(%)=×100%

Lovastatin含量测定:采用高效液相色谱法,色谱条件如下:色谱柱:Spherisorb ODS 100×4.6 mm;流动相:甲醇-18 mmol/L磷酸溶液(体积比为77.522.5);流速:0.5mL/min;紫外检测波长:237nmLovastatin标准品由浙江海正药业股份有限公司提供,纯度高于99%

 

2  结果与讨论

2.1基质初始含水量对固态发酵的影响

固态发酵是不溶性底物在足够的湿度但无游离水的状态下进行微生物发酵的过程。在固态发酵时,孢子萌发及菌丝生长都需要适宜的水分,因此控制基质含水量是固态发酵过程中的重要环节之一。

对不同含水量的固体培养基,接种相同量(大米干重10%的种子液)的红曲霉液体种子,进行培养,结果见表1

 

1  基质初始含水量对红曲霉生长和Lovastatin产率的影响

大米初始含水量(%

发酵现象

干物质得率(%

Lovastatin得率(mg/g

20

发酵过程中较干燥

80.9

0.35

40

发酵过程中产生少量游离水

68.8

1.35

60

湿润,不产生游离水

50.8

1.19

80

湿润,不产生游离水

45.5

1.03

 

当含水量为20%时,物料干硬,菌体生长情况很差,发酵曲中Lovastatin的含量也很低;含水量增加到40%时,发酵的第12天菌体长势良好,由于有较多的热量产生,两天后物料开始结块,底部有红色粘稠液体产生;而含水量为60%80%时,物料也出现结块,但却不再产生游离水,物料发酵较透,干物质的得率明显低于含水量为20%时。究其原因可能是:在培养基灭菌时,适宜的含水量将使米内的颗粒排列疏松,有利于菌丝体很快繁殖。菌体对底物的迅速代谢过程中生成一定量的水,弥补了发酵过程中水分的挥发,使固态培养基维持较高的含水量。这种良好的水的微环境有助于淀粉酶的扩散以及淀粉水解后葡萄糖和其他盐类的扩散,可更快地被菌体吸收利用。当含水量超过60%时,在基质灭菌时将使基质变得粘稠,孔隙减小,在培养过程中通气变差,使Lovastatin的产量降低。从表1的结果可知,40%含水量时Lovastatin的产率最高。

 

2.2培养基成分对发酵和Lovastatin产量的影响

2.2.1 添加碳、氮源对发酵的影响

传统的红曲霉固态发酵一般都采用大米作为培养基。一般籼稻米质较疏松,淀粉中含直链淀粉多,米饭胀性大而粘性差,较易消化吸收;粳稻米质较紧密,米饭胀性小而粘性强,但比籼米难消化;糯米的淀粉全部为支链淀粉,粘性很强,较难消化吸收,一般不作为培养基质用。实验中对籼米和粳米的发酵情况进行了比较,结果发现:籼米在发酵过程中较干燥,菌丝很难生长到大米内部。粳米则比较容易被红曲霉利用,发酵过程中培养基结成疏松的块状,有利于保持水分,使培养基在发酵过程中一直保持湿润的状态。

单纯使用大米进行培养时,红曲霉的生长速度很慢。菌种接种到培养基后,菌体不能很快将培养基表面占据,培养基中的水分就特别容易挥发,使得培养基变得干燥从而更难被菌体利用。大米的主要成分是淀粉,需要在淀粉酶的作用下水解为葡萄糖后才能被菌体利用。由于刚接种时菌丝体量少、淀粉酶活力低,无法满足菌体生长对碳源的需求。另外,大米中的氮源不足,这是造成发酵困难的另一主要原因。因此,如果能在固态培养基中添加适量可溶性的而且容易利用的碳源及氮源,将有利于菌体生长和提高Lovastatin产率。由表2可以看出在大米中添加各种碳、氮源对红曲霉生长和Lovastatin产率的影响。

 

2   碳、氮源的添加对发酵的影响

添加物

发酵情况

干物质得率(%

Lovastatin含量(mg/g

早期生长缓慢,发酵过程中很干燥,培养基不结块

89.2%

0.94

玉米粉5%

早期生长较快,发酵过程中干燥,培养基不结块

79.3%

1.35

葡萄5%

早期生长较快,发酵过程中干燥,培养基结块

75.1%

1.57

黄豆粉10%

早期生长较快,发酵过程中干燥,培养基不结块

82.6%

1.49

蛋白胨5%

早期生长较快,发酵过程中干燥,培养基结块

73.2%

1.53

葡萄糖5%+复合氨基酸5%

早期生长快,一天表面即布满白色菌丝;发酵过程中较湿润,培养基结块

45.4%

2.38

葡萄糖5%+蛋白胨5% +酵母粉4%

早期生长快,一天表面即布满白色菌丝;发酵过程中较湿润,培养基结块

69.2%

2.59

葡萄糖5%+花生饼粉5%

早期生长较快,发酵过程中干燥,培养基结块

61.5%

2.06

注:“—”表示不添加。

 

由表2可以看出,大米中单纯添加碳源或氮源,对发酵的促进作用都不是很大,只有碳源和氮源同时添加才能够发挥明显的效果。在所研究的氮源中,蛋白胨和酵母粉同时添加以及添加复合氨基酸的效果最好。从实验结果分析,工业上常用的玉米粉、黄豆粉以及花生饼粉等的效果不如蛋白胨等,但若从降低成本的角度考虑,可以适当减少蛋白胨、酵母粉以及复合氨基酸的用量,加入适量的黄豆粉、花生饼粉。

2.2.2  蔬菜浸出汁对发酵的影响

本研究所用的红曲霉菌株在单纯大米培养基上生长比较慢,碳源的利用率低,原因之一可能是大米中缺少维生素等生长因子,而各种蔬菜浸出汁中生长因子的含量较丰富,因此研究了三种蔬菜浸出汁对发酵的影响,实验结果见表3

 

3  蔬菜浸出汁对发酵的影响

浸出汁

发酵现象

干物质得率(%

Lovastatin产量(mg/g

pH4.0自来水

湿润,但无红色液体产生

69.3

2.59

西红柿汁

产生大量红色粘稠液体

57.1

2.83

胡萝卜汁

湿润,产生少量红色粘稠液体

52.8

2.74

萝卜汁

湿润,产生少量红色粘稠液体

56.2

2.65

红曲米浸泡水

发酵过程中产生大量红色粘稠液体

42.6

3.05

注:添加量均为每50g/500mL三角瓶中加入20mL浸出汁。

 

由表3可以看出,三种蔬菜浸出汁的加入均能促进菌体生长,使基质的利用增加,发酵进行得比较彻底,从而也促进了Lovastatin的产量提高。

红曲霉能够产生多种代谢产物,其发酵大米所得的红曲米中,不仅含有大量菌体物质,还含有大量的代谢产物,可能会存在一定量的Lovastatin合成的前体物质,因此考虑在培养基中,添加红曲米浸泡水来考察其对发酵的影响情况,结果证实(见表3)红曲米浸泡水的加入确实对发酵有着较大的影响,Lovastatin的产量也有明显提高。

 

2.3  大米粉碎度对发酵的影响

大米的粉碎度影响发酵过程中的通气状况以及基质与菌丝的接触面积。粉碎度大,米的颗粒小,在发酵过程中通气状况好,而且增大了基质与菌丝的接触面积,有利于菌丝对基质的利用,但是,米粉碎以后也存在一定缺点,就是大米粉碎后,在浸米的过程中营养成分的损失较大。表4比较了粉碎至10目和未粉碎的米的固态发酵结果。

 

4  大米粉碎度对发酵的影响

米的颗粒度

发酵情况

干物质得率(%

Lovastatin产量(mg/g

未粉碎

发酵过程中结块严重

68.3%

2.59

粉碎至10

发酵过程中轻度结块

63.5%

2.85

 

由表4可以看出,大米经适当粉碎后,可以改善发酵状况,避免严重结块,有利于提高Lovastatin的产量,但是需要注意浸米过程中的营养损失问题。

 

2.4  浅盘固态发酵

浅盘固态发酵具有设备简单、氧传递阻力小及温度和湿度控制方便等优点,是工业上常用的固态发酵设备。表5列出了红曲霉浅盘固态发酵产Lovastatin的实验结果。从表中数据可以看到,浅盘发酵时Lovastatin的产量稳定,但略低于三角瓶发酵。通过进一步优化浅盘发酵的操作条件,有望进一步提高Lovastatin的产率。

 

5浅盘固态发酵产Lovastatin的实验结果

发酵方式

实验次数

Lovastatin的产率

浅盘固态发酵

1

2.35


2

2.41

3

2.38

三角瓶固态发酵


2.59

 

2.5  红曲霉与土曲霉产Lovastatin的比较

 

6  红曲霉与土曲霉产Lovastatin的比较

发酵方式

菌种

Lovastatin的产率

固态发酵

红曲霉

2.59mg/g

液态深层发酵

红曲霉

0.041(mg/mL)

土曲霉

3-4(mg/mL)[7]

6中对红曲霉和土曲霉在不同发酵方式下Lovastatin的产率进行了比较,其中红曲霉进行液态深层发酵的结果是本实验室得到的,土曲霉是目前工业发酵生产Lovastatin的主要菌种,表中数据代表了目前的工业发酵水平。可以看到,红曲霉固态发酵时Lovastatin的产率要比液态深层发酵高约两个数量级;即使与土曲霉发酵的工业生产数据相比,红曲霉固态发酵也毫不逊色,而且红曲霉固态发酵产物无须提取即可直接利用,而液态深层发酵需要经过复杂分离过程。

 

3 结论

本文主要研究了红曲霉固态发酵中对产量影响较大的基质营养成分以及基质状态,发现以梗米作为主要原料,固体基质的含水量控制在40%左右,并适当补充速效利用碳、氮源可以提高Lovastatin的产率;在固态培养基中添加西红柿汁、胡萝卜汁、萝卜汁和红曲米浸泡水都有利于Lovastatin的合成;大米的适当破碎可以改善传质和传热,从而促进Lovastatin的合成。红曲霉固态发酵的Lovastatin产率比液态深层发酵高约两个数量级,与目前工业上土曲霉发酵生产Lovastatin的产率类似,因此具有工业应用前景。

  

参考文献

[1] Endo A. Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species[J]. J. Antibiotics, 1979, 32(8):852-854.

[2] Endo A. Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase[J]. Antibiotics, 198033(3)334-336.

[3] 韩梅,李秉慧。红色红曲霉菌发酵提取液降胆固醇作用的研究[J].微生物学报,1994215):279-280

[4]  毛宁,陈松生。降脂红曲霉的生产研究[J].中国酿造,1997514-16

[5]  高嘉安,郭东,王德辉等。产Monacolin K红曲霉菌的筛选及发酵条件的研究[J].吉林农业大学学报,1997193):85-90

 

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