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红曲霉所产次级代谢物γ-氨基丁酸的研究

作者:天曲生物 日期:2020-10-15 20:56:52 点击数:4

红曲霉所产次级代谢物γ-氨基丁酸的研究



孙佰申  周立平 


(浙江工业大学生物与环境工程学院,杭州 310014)



摘要:红曲霉所代谢的生理活性物质除Monacolins外,尚含有麦角甾醇(Ergosterol)、γ-氨基丁酸(GABA)、多糖等,均已引起国内外学者的极大兴趣。本论文探讨优化了实验菌株Monascus pilosus GM100发酵产GABA的配方与工艺,并对其作了生产性试验。结果显示在优化的培养基组分及工艺条件下,实验菌株 Monascus pilosus GM100三角瓶液体发酵产GABA量为38.5μg/ml,固体发酵产GABA量为610mg/kg。采用100L发酵罐及通风曲池对Monascus pilosus GM100菌株产GABA进行扩大培养,实验表明发酵滤液的GABA含量达180μg/ml,发酵液菌体中GABA含量为710μg/g;通风曲池生产的红曲米GABA的含量达390μg/g,经48h CO2厌氧处理,可提高至470μg/g。


关键词:Monscus spp.   GABA   固液体发酵


The Research Of Sub-metabolized Substances—γ-aminobutyric acid

By Fermentation of Monascus Spp.


Sun Baishen   Zhou Liping


(Zhe Jiang University Of Technology, Hang Zhou, 310014)


Abstract:Many researchers at domestic and overseas have being highly interesting in some physiological active substances such as γ-aminobutyric acid(GABA) , ergosterol , polysaccharide and so on except for Moncolins. This thesis is to study the fermentation constituent and conditions of GABA by the object Monascus pilosus strain. We also research large scale production of GABA by Monascus pilosus GM100 strain.The results show the content of GABA is 38.5μg/ml in the fermentation filtrate by liquid fermentation production and 610mg/kg in red koji rice by solid-state fermentation production of the object Monascus pilosus GM100 strain in optimal conditions of technical culture medium constituent and conditions.GABA production by liquid fermentation in 100L fermentor and koji-making through ventilation of Monascus pilosus GM100 are studied.The content of GABA is 180μg/ml in the fermentation filtrate and 710μg/g in the mycelium by liquid fermentation, 390μg/g in the red koji rice by fermentation of koji-making through ventilation and 470μg/g through 48h anaerobic treatment of CO2.


Key words: Monscus spp.   GABA    liquid and solid-state fermentation


1前言

γ-氨基丁酸(GABA)的降血压作用在以前的研究中早有报道[1]。1986年,Tsuji等报道了长期服用M. pilosus生产的红曲可减少SHR血压的提高[2]。1987年, Kohama等[3]自红曲分离出GABA及乙酰胆碱,其红曲中所含GABA约为此认为降血压的有效成分为GABA或某种缩氨基酸(peptide)。1992年,日本国立健康营养研究所Keisuke TSUJI博士等在进行饲料添加“红曲培养物”的动物试验中,发现添加0.2%-0.3%“红曲培养物”的饲料可使患有原发性高血压症老鼠(Spontaneously Hypertensive Rats,SHR)的血压由超过200mmHg降至180mmHg以下,其有效成分为γ-氨基丁酸(GABA)及Glucosamine(或红曲的其他细胞壁成分)[4]。1995年,Inoue等[5]研究表明每日摄入一定量的Monascus pilosus IFO 4520菌种发酵而得到红曲,证明作为一种用于保护健康食品有治疗高血压的作用。GABA的降血压原理:人体的神经元细胞上有GABAa和GABAb两种受体(receptor),其中GABAa受体接受GABA的刺激之后,会抑制肾上腺素分泌儿茶酚胺(catecholamine,一种交感神经传递物),可减弱交感神经的作用,使血压降低。其代谢途径如图1所示。


图1 GABA支路及其与其它代谢途径的关系

Fig.1 The relation of bypass of GABA and its biosynthetic pathway


红曲霉菌(Monascus spp.),这一先人留给后世的宝贵菌物资源,在千年之后已成为热门话题,其研究正方兴未艾,其必将成为生物科技的明日之星。

目前已发现多种微生物能产生GABA,其中以红曲霉和乳酸菌更为引人瞩目。据不完全统计,M. anka,M.anka,M.pilosus,M.purpureus,M.ruber,M.vitreous等均能代谢产生GABA。 本文主要研究了Monascus pilosus GM100菌株固液态发酵产GABA,并对其作了生产性试验。


2材料与方法

2.1实验菌种

Monascus purpureus SM001、SM005;Monascus ruber GM088; Monascus pilosus GM100。


2.2培养基

2.2.1试管斜面培养基:按麦芽:水=1:4(g:v)比例混合,于60℃水浴糖化至12ºBX后,经煮沸加鸡蛋清再煮10min后过滤。用乳酸调节pH值至4.8,加1.8%琼脂,分装18×180cm试管。经0.098MPa灭菌30min,制斜面,斜面长度达到试管的1/2为宜。

2.2.2固体发酵培养基:蒸米50g/500ml三角瓶。

2.2.3液体种子培养基

大米粉3%,葡萄糖3%,NaNO3 0.2%,KH2PO4 0.15%,MgSO4·7H2O 0.1%, pH4.2,并经0.098MPa下灭菌30min。

2.2.4液体发酵培养基

大米粉6%,黄豆粉1.5%,NaNO3 0.5%,KH2PO4 0.15%,MgSO4·7H2O 0.1%, pH自然,并经0.098MPa下灭菌30min。

2.2.5培养方法

试管斜面培养: 试管斜面接种后,于生化培养箱中330℃培养4~5d。

液体种子培养:将已培养好的新鲜斜面菌种,用接种针划下表面菌丝,接种到种子培养基中,在30℃、200r/min的旋转式摇床上培养48h。

摇瓶液体发酵培养:将培养好的种子液按10%的接种量接种于装有100mL发酵培养基的500mL三角烧瓶中,在30℃、150r/min的旋转式摇床上培养3d后,降温至28℃、150r/min继续培养9d。

固体发酵培养:(1) 浸米:在室温下将籼米浸于水中,浸米时间为6~8h(冬春季)或3~5h(夏秋季),吸水量在28~30%。(2) 培养基的制备:大米捞出后用清水淋洗,去除大米外层糠粉,沥干水份后在敞口的状态下,121℃蒸米20min。捣散米饭并摊凉至温度40~42℃,分装成50g/500ml三角瓶(可补加各种营养成分),最后121℃灭菌30min,待冷却至36~38℃时,摇动米饭使之吸附三角瓶内壁的冷凝水,之后用灭过菌的10ml移液管接10%种子液于三角瓶米饭中。(3) 固体培养方法:接种后将米饭和曲种摇匀,堆于三角瓶的一角,置32~34℃培养,经2~3d,待大部分饭粒上可见到菌丝时,扣瓶一次使之吸附瓶壁上的冷凝水,并将米饭摊平,之后降温至26~28℃培养。待曲粒由白色变为浅红色后,将曲粒扣散摊平,以后每天扣瓶3~4次,并视曲粒的干湿状况酌情加无菌水增湿,一般培养14~15d曲成熟。


2.3 分析方法

2.3.1生物量测定:发酵液用三层纱布过滤,洗涤两遍,挤干,再用粗滤纸反复压干,称重,为湿菌体生物量。将湿菌体于80℃烘箱中烘干至恒重,为干菌体生物量,并计算含水量。

2.3.2出曲率计算方法:将培养好的曲于40℃烘干,保持曲中水分8%~10%以下即可,称取其质量与发酵底物原料总质量之比即为出曲率。



2.3.3 GABA得率=

GABA含量×发酵物干重

发酵底物原料总质量



2.3.4干物质得率=固体发酵物干重/固体发酵底物原料总质量。

2.3.5固体发酵工艺流程: 

2.3.6 GABA含量的测定方法:采用HPLC-ELSD法及氨基酸分析仪法。


3 结果与讨论

3.1 GABA的测定方法

3.1.1HPLC-ELSD法定量红曲霉发酵样品中的GABA

1) GABA标准品及红曲霉发酵样品的色谱图,见图2和图3。


图2  GABA标准品的色谱图(tR =7.015)

Fig.2 The HPLC figure of GABA standard solution


图3 红曲霉发酵液样品的色谱图(GABA的tR=7.015)

Fig.3 The HPLC figure of ergosterol in the filtrate by liquid fermentation

by Monascus pilosus


2) 标准曲线:见图4。

Fig.4 The criterion curve of GABA solution


3.1.2 氨基酸分析仪法(略)。


 

3.2菌种的选择

Monascus purpureus SM001、SM005;Monascus ruber GM088; Monascus pilosus GM100按照2.5中所述摇瓶液体发酵培养方法进行液体发酵。菌体的生长状况和GABA产量高低情况见表1。


表1  不同红曲霉菌株的生长状况和GABA的产量

Table 1 The yield of GABA and the growth condition of different

Monascus spp. strains

菌株

菌株生长状况的肉眼观察

发酵液中GABA(μg/ml)

发酵液菌体中GABA (μg/g)

菌体鲜重(g)

SM001

菌体呈絮状,瓶壁有一圈稀薄红色的菌体,发酵液呈深紫红色。

8.6

SM 005

菌体呈絮状,瓶壁有一圈稀薄的菌体,发酵液呈深红色。

7.9

GM 100

菌体呈细丝状均匀分布在发酵液中,瓶壁有一圈白色菌体,发酵液呈紫红色。

5.5

40

18.6

GM 088

菌体呈细丝状均匀分布在发酵液中,瓶壁有一圈很浓密的白色菌体,发酵液呈浅紫红色。

1.4

15

11.

— 表示未检出。

液体发酵培养基:大米粉6%,黄豆粉1.5%,NaNO3 0.5%,KH2PO4 0.15%,MgSO4·7H2O 0.1%, pH自然,100ml/500ml三角瓶,并经0.098MPa下灭菌30min。

由表1可见,不同实验所选红曲霉菌株产GABA能力有差异,这可能是菌株本身特性所决定的。Monascus purpureus SM001、SM005菌株不产GABA,而Monascus ruber GM088和Monascus pilosus GM100菌株均产GABA,且以Monascus pilosus GM100产GABA含量较高。故以下选用Monascus pilosus GM100为实验菌株。


3.3碳源的选择

在由100ml/500ml三角瓶含有1.5g豆粉,0.5gNaNO3,0.15gKH2PO4,0.1gMgSO4·7H2O, pH自然的液体发酵培养基中,分别添加5种不同碳源6g,进行Monascus pilosus GM100液体发酵实验,结果见表2。


表2 不同碳源对Monascus pilosus GM100产GABA产量的影响

Table2 The influence of different carborn sources on the liquid

fermentation of GABA by Monascus pilosus GM100


碳源

葡萄糖

蔗糖

大米粉

可溶性淀粉

甘油

乳糖

发酵液中GABA(μg/ml)

1.6

1.3

4.8

9.8

7.4

— 表示未检出

由表2看出,Monascus pilosus GM100液体发酵时,可溶性淀粉及乳糖作为碳源较好,大米粉次之。

 

3.4氮源的选择

在100ml/500ml三角瓶中含有6g大米粉,0.15gKH2PO4,0.1gMgSO4·7H2O, pH自然组成的培养基中,各添加不同氮源2g,进行Monascus pilosus GM100液体发酵实验,结果见表3。


表3 不同氮源对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

Table 3 The influence of different nitrogen sources on the liquid

fermentation of GABA by Monascus pilosus GM100


氮源

黄豆粉

MSG

NaNO3

酵母粉

发酵液中GABA(μg/ml)

6.2

1.8

1.3

13


由上表3看出,Monascus pilosus GM100液体发酵时,酵母粉是较佳的氮源,黄豆粉次之,NaNO3较差。

3.5发酵培养基初始pH的选择

在100ml/500ml三角瓶中含有6g大米粉,1.5g豆粉,0.5gNaNO3,0.15gKH2PO4,0.1gMgSO4·7H2O组成的培养基中,调不同pH进行Monascus pilosus GM100液体发酵实验,结果见表4。


表4 液体发酵培养基初始pH对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

Table 6.4 The effect of pH on the liquid fermentation of GABA by

Monascus pilosus GM100



pH

3.8

4.8

5.2

5.6

发酵液中GABA(μg/ml)

3.5

3.3

2.6

1.3



图5 液体发酵培养基不同初始pH对GABA生产的影响

Fig.5 The effect of pH on fermentation of GABA


由表4及图5可以看出,Monascus pilosus GM100液体发酵,液体发酵培养基初始pH值3.8较好,4.8次之。究其原因可能是红曲霉GAD存在于胞内,以磷酸毗哆醛(维生素B6)为辅酶,其最适pH为4.5,当pH值增加时,其活性要下降很多。由于GAD的活性不仅能被H+激活,而且在其催化Glu脱羧的反应中要消耗质子(L-Glu+H+→GABA+CO2),因而GABA的合成、消耗质子,可降低胞质的酸化程度。pH的降低,有利于Glu脱羧,不利于GABA转氨作用(因GABA-T最适pH8~10),从而积累GABA。


3.6 Monascus pilosus GM100液体发酵产GABA的周期

在100ml/500ml三角瓶中含有6g大米粉,1.5g豆粉,0.5gNaNO3,0.15gKH2PO4,0.1gMgSO4·7H2O,pH3.8组成的培养基,进行Monascus pilosus GM100液体发酵。不同时间各取2瓶发酵液,分别测定GABA含量、生物量、pH值等,作液体发酵周期图,结果如图6。


图6  Monascus pilosus GM100液体发酵周期

Fig.6 The curves of fermentation of GABA by Monascus pilosus GM100


从图6可以看出,进行Monascus pilosus GM100液体发酵,菌体量随着发酵时间的增加,先增加后减少,这可能是由于前期红曲霉充分利用培养基营养快速繁殖,后期由于营养成分匮乏,菌体开始出现自溶现象。pH随着培养时间增加,前期快速升高,后期有所下降。前期pH虽有过达到红曲霉GAD较适的pH值,但此时GAD相对较少(GAD存在于胞质中,此时菌体量偏少);后期pH虽偏高于红曲霉GAD的较适值,但培养时间12d时pH相对娇小,此时红曲霉GAD活性损失最小,且此时菌体量较大,故有可能GABA含量能达到较大值。因此选择发酵周期为12d。


3.7通气量对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

1)静态培养与摇床转动培养比较

发酵培养基在30℃、150r/min的旋转式摇床上培养3d后,分别于28℃、150r/min继续摇床培养9d和28℃生化培养箱静置培养9d,结果见表5。


表5 不同培养方式对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

Table 5 The effect of static culture and shaking culture on the

 formation of GABA by Monascus pilosus GM100


培养方式

菌株生长状况的观察

发酵滤液GABA(μg/ml)

发酵液菌体中GABA(μg/ml)

静置培养

发酵液表面有一层呈膜状的白色菌体,膜下面为稀薄发酵液,具体可长时间保持白色。

34

150

摇床培养

菌体呈细丝状均匀分布,瓶壁有一圈白色菌体,发酵液呈紫红色。

6.85

43


2) 摇瓶装量对GM100产GABA的影响

500ml三角烧瓶分别装入不同量的培养基,液体发酵结果见表6及图7。

表6 不同装液量对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

Table.6 The effect of different medium volumes on the liquid fermentation of GABA by Monascus pilosus GM100


装液量(ml

50

75

100

125

发酵滤液GABA(μg/ml)

3.43

5.86

7.01

8.24


液体发酵培养基:大米粉6%, 豆粉1.5%, NaNO30.5%, KH2PO40.15%, MgSO4·7H2O 0.1%,pH3.8。



图7 液体发酵培养基装量对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

Fig. 7 The effect of medium volume on the liquid fermentation of GABA

by Monascus pilosus GM100


由表4、 5及图7可以看出,Monascus pilosus GM100液体发酵后期供氧减少可增加GM100产GABA。究其原因可能是缺氧条件下还原电位增高,即NADH/NAD+比值变大,ADP转化为ATP,从而使SSADH活性降低,催化SA的反应减弱,有利于GABA的代谢进行。


3.8 微量元素对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

在100ml/500ml含有6g大米粉,2.0g黄豆粉,pH3.8的培养基中,各添加0.15g微量元素,考察其对Monascus pilosus GM100产GABA的影响,结果见表7。



表7 微量元素对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

Table 6.7 The effect of trace elements on the liquid

fermentation of GABA by Monascus pilosus GM100


微量元素

Ca2+

K+

维生素VB6

Mn2+

空白

发酵滤液GABA(μg/ml)

20.6

10.8

13.6

7.54

6.94



由表6.7可看出,Ca2+对Monascus pilosus GM100液体发酵产GABA促进较大,维生素VB6、K+次之,Mn2+亦对其有所贡献。究其原因分别可能是GAD可以被Ca2+和CaM激活,Ca2+增多,有利于形成有活性的酶Ca2+与CaM复合体,从而使GAD活性增加,最终导致GABA积累;GAD是磷酸吡哆醛(Pyridoxal5’phosphate,PLP,即维生素B6)与蛋白质的复合物,GAD通过PLP与apoGAD的解离和聚合调节其自身的活性,维生素VB6的增加,使PLP与apoGAD的聚合增加,从而使GAD活性也相应地提高。K+主要使细胞膜去极化,离子通透性增加,使菌体内GABA更多的释放至发酵滤液中。


3.9较佳培养条件下Monascus pilosus GM100产GABA情况

通过上述实验得到Monascus pilosus GM100产GABA的初步条件:可溶性淀粉6%,酵母粉2%,CaCl2•7H2O 0.15%,维生素VB6 0.15%,KH2PO4 0.15%,MgSO4·7H2O 0.1, pH3.8。接种量10%,种龄为48h,装液量 100ml/500ml三角烧瓶,在30℃、150r/min的旋转式摇床上培养3d后,28℃、150r/min继续培养9d。在此条件下,平行实验3次,最后得到发酵滤液中GABA的平均产量为38.5μg/ml。


4.0 Monascus pilosus GM100固态发酵

4.01大米的选择


表8 不同稻米培养基对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

Table8 The effect of different rices on the formation of ergosterol by

Monascus pilosus GM100


培养基

发酵物干重(g)

红曲米中GABA (mg/kg)

长粳米(东阳种子公司)

23.5

330

粳米(东北大米)

26.8

260

籼米(临海)

28.5

130

碎米(籼米)

27.6

200


从表8 可以看出,大米种类对Monascus pilosus GM100固体发酵存在很大的影响,实验结果显示长粳米较好,粳米次之,籼米较差。米的粒度对固体发酵亦有影响,采用碎米优于完整颗粒。

4.02 氮源的选择

50g粳米饭/500ml三角瓶作固体发酵培养基,分别添加不同氮源(1%),进行Monascus pilosus GM100固体发酵,结果见表9。


表9 不同氮源对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

Table 9 The effect of different nitrogen sources on the solid-state fermentation of

GABA by Monascus pilosus GM100


氮源

硫酸铵

NaNO3

酵母粉

MSG

空白

GABA (mg/kg)

263

280

276

298

264


由表9可知,MSG的添加对Monascus pilosus GM100固体发酵产GABA的含量增加影响较大,酵母粉、NaNO3次之,而硫酸铵对固体发酵并无作用。


4.03 微量元素对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

50g粳米饭/500ml三角瓶作固体发酵培养基,各添加0.15%的微量元素,进行Monascus pilosus GM100产GABA的固体发酵,结果见表10。


表10 不同微量元素对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

Table 10 The effect of different trace elements on the solid-state fermentation of

GABA by Monascus pilosus GM100


微量元素

磷酸二氢钾

硫酸镁

氯化钙

硫酸锰

空白

GABA (mg/kg)

269

265

285

274

262



由表10可知,KH2PO4,CaCl2•2H2O,MnSO4•4H2O均对Monascus pilosus GM100固体发酵产GABA有促进作用。

4.04 CO2处理对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

据报导,用N2、CO2厌氧处理可提高GABA含量十倍左右,本实验对Monascus pilosus GM100产GABA后期用CO2厌氧处理。50g粳米饭/500ml三角瓶作固体发酵培养基,各添加0.1%的微量元素,进行Monascus pilosus GM100产GABA的固体发酵,后期并进行为期2~3d的厌氧处理,维持压力0.04MPa,28℃静置培养。


表11  厌氧处理后不同微量元素对Monascus pilosus GM100产GABA的影响

Table11 The effect of anaerobic treatment with CO2 on the fermentation of GABA

 by Monascus pilosus GM100


微量元素

磷酸二氢钾

硫酸锌

氯化钙

硫酸锰

谷氨酸

空白

GABAmg/kg

510

450

450

610

380

264(未经厌氧处理)



4.1 Monascus pilosus GM100产GABA规模化生产

4.1.1 实验菌种:Monascus pilosus GM100

4.1.2培养基

4.1.2.1 试管斜面培养基:见2.2.1

4.1.2.2一级摇瓶培养基组成(%)

 

12  一级摇瓶培养基组成

原料

含量(%)

原料

含量(%)

大米粉(≤80目)

3.0

NaNO3

0.2

黄豆饼粉(≤80目)

1.0

KH2PO4

0.1

葡萄糖

2.0

MgSO4·7H2O

0.1

酵母粉

1.0



乳酸调pH3.8~4.0,经0.1Mpa,121℃灭菌35min以上。

 

4.1.2.3二级摇瓶培养基组成(%

培养基配方同一级摇瓶,乳酸调pH4.5,经0.1Mpa,121℃灭菌30min以上。

4.1.2.4 100L发酵罐配料组成(%

13  100L发酵罐配料组成

原料

添加量(g

原料

添加量(g

大米粉(≤80目)

2400

NaNO3

160

黄豆饼粉(≤80目)

800

KH2PO4

80

葡萄糖

1600

MgSO4·7H2O

80

酵母粉

800

乳酸

4.0

乳酸链霉菌素

12




4.1.3 培养方法

4.1.3.1试管斜面培养:见2.2.5。

4.1.3.2一级种子培养

将已培养好的新鲜斜面菌种,用接种针将表面菌丝划破成小块,接种到装有100ml液体种子培养基的500ml三角烧瓶中,在30℃、200r/min的旋转式摇床上培养48h。


4.1.3.3二级摇瓶

一级摇瓶以8%的接种量接入二级摇瓶(宜采用吸管或移种管接种),摇瓶置200r/min、30℃培养24h可用,届时视生产情况降低培养温度2~4℃,延长培养时间至36h左右,色泽微红,菌体量比较大,然后在无菌条件下装入,接种用不锈钢瓶。培养开始时可适当放低摇床转速至150r/min,数小时后再提高至200r/min。接种完毕将液体菌种同时接入细菌培养基平皿,在37℃下培养观察。


4.1.3.4 100L发酵罐培养

打开阀门通蒸汽空消,在0.1Mpa,121℃压力下灭菌30min。然后进压缩空气,打开投料口加入物料。按85L培养液的料量配置成55L左右料液。加料时应边搅拌,边加料,然后通蒸汽进行实消。当温度上升至90℃以上时,关闭搅拌。当温度升高到121℃、压力0.1MPa下灭菌时间40min左右,实消完毕通无菌空气保压,并打开搅拌开通冷凝水冷却至32℃后用接种瓶接入4L二级种子液,将温度控制在32℃左右;前期空气流量1:0.4(料液量:空气量),当菌体生长旺盛后将空气流量提高到1:0.8;控制柜电机旋转频率35~40HZ,培养24~28h。

或在实消完毕冷却至34℃时,用接种瓶接入2L孢子悬浮液,将温度控制在34℃;前期空气流量1:0.4(料液量:空气量),当菌体生长旺盛后将空气流量提高到1:0.8;控制柜电机旋转频率35~40HZ,培养3~4d。

 

4.1.3.5 通风曲池功能性红曲生产

曲房及曲池事先打扫彻底杀菌(高锰酸钾甲醛溶液),麻袋等工具经121℃,0.1Mpa压力杀菌30min后,通入无菌空气,保持室内正压。

发酵罐放料后,用冰醋酸调菌体pH至3.5左右,以10%的接种量接入冷却后的米饭中。接种后,当品温回升到45℃,第一次翻曲。控制温度45℃→43℃→41℃→39℃→37℃翻曲,2d以后,待菌丝体基本布满米粒开始第一次喷水(小水),然后将温度控制在37℃~39℃,曲池每5~6小时翻曲一次,米粒呈干燥状可喷水。培养时间9~12d,烘曲,整个培养过程曲池温度避免超过45℃。GABA产量为470ppm。其生产工艺流程见图8:

 

 

 

                             试管菌种

                ↓                   ↓

                                           一级摇瓶

                              ↓                   ↓

               二级摇瓶

↓                   ↓

                发酵罐

  ↓                        

                       

  ↓

  

曲房堆积培菌

通风曲池培养

  ↓

  

  

出曲干燥

成品红曲

 

通风制曲生产工艺流程

 

4.1.4厌氧处理效果

大生产红曲米培养结束后,在空发酵罐中进行厌氧处理,通入CO2钢瓶气,保持温度28,压力0.04MPa。发酵罐中发酵液也通入CO2钢瓶气,维持罐压0.04MPa28静置培养7d,结果见表14及15

 

14 CO2厌氧处理后红曲米中γ-氨基丁酸含量的变化

Table14 Changes inγ-aminobutyric acid content of  red koji rice under CO2 anaerobic treatment

Time of CO2 treatment

(h)

GABA content

(μg/g)

0

390

24

410

48

470

 

15 CO2厌氧处理后发酵滤液及发酵液菌体中γ-氨基丁酸的含量

Table15  The content ofγ-aminobutyric acid under anaerobic treatment

CO2 处理时间

(h)

发酵液菌体GABA 含量

(μg/g)

发酵罐内壁附着菌体GABA 含量(μg/g)

发酵滤液GABA 含量(μg/ml)

7d

710

600

180


由表14可看出,经过厌氧处理能显著提高GABA的含量,大生产红曲米(390μg/g)中GABA的含量比三角瓶固体发酵(330μg/g)提高18%以上,经厌氧处理48h后提高40%以上;发酵罐培养的发酵滤液中GABA含量(180μg/ml)比三角瓶液体发酵GABA最高含量(38.5μg/ml)提高了4.68倍,菌体中GABA含量提高了17.75倍。由此可见大规模生产的优越性。


4.1.5菌体量变化

固态培养红曲的菌体量可以用氨基葡萄糖来衡量。氨基葡萄糖是菌体细胞壁几丁质的基主要成分。细胞壁的厚度随着菌龄而增加,而菌龄大或营养不良时,空菌丝及孢子较多,细胞所占比例加大,会导致氨基葡萄糖含量偏高。


4.1.6氨基葡萄糖含量标准曲线的绘制:

准确称取适量的氨基葡萄糖标准品,配成系列溶液,用722型分光光度计在530nm处测OD值。以浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘制氨基葡萄糖含量的标准曲线。


Fig.9 The criterion curve of glucosamine solution


4.1.7通风曲池培养过程中菌体量变化


通过测定氨基葡萄糖含量来反映固态培养红曲的菌体量,结果见图10。


图10 发酵物中氨基葡萄糖含量随培养时间变化

Fig.10 The changes of the content of glucosamine during incubation time


Monascus pilosus GM100通风曲池培养红曲过程中,氨基葡萄糖含量开始随着培养时间增加逐渐增大,8d后达到最大值,可能此时估计菌体大都成熟,有限的营养限制了菌丝体的生长,使其大部分进入成熟期及衰老期,同时孢子增多质膜加厚,从而使氨基葡萄糖含量重新增加。


4.1.8通风曲池培养过程中α-amylase及β-amylase活性的变化

功能性红曲大生产过程中,α-amylase及β-amylase活性变化,见图11。


图11发酵物中淀粉酶活力随培养时间变化

Fig.11 The change in the production of amylase by Monascus pilosus GM100

during incubation time


4.1.8通风曲池培养过程acid protease活力的变化

Monascus pilosus GM100通风曲池生产过程中,acid protease活力的变化,见图12。

图12发酵物中酸性蛋白酶活力随培养时间变化

Fig.12 The change in the production of acid protease by Monascus pilosus GM100

during incubation time


5 结论

本研究筛选得到目标菌Monascus pilosus GM100,用HPLC-ELSD法及氨基酸分析仪法定量GABA进行了研究。优化了培养基组分及工艺条件下,Monascus pilosus GM100菌株液体发酵产GABA量为38.5μg/ml,固体发酵产GABA量为710mg/kg。并采用100L发酵罐及通风曲池对Monascus pilosus GM100菌株产GABA进行规模化培养,试验表明发酵滤液中GABA含量达180μg/ml,发酵液菌体中GABA含量为610μg/g;通风曲池生产的红曲米GABA的含量达390μg/g,经48h CO2厌氧处理,可提高至470μg/g。

自1979年,日本农工大学远藤氏从泰国M. ruber中分离出Monacolin K之后,世界各国科学家加大了对红曲霉的研究,其次级代谢产物均受到了极大关注。1998年7月在法国图卢兹大学以及2000年10月在浙江工业大学先后举办了两届红曲国际学术研讨会,而今又将于2004年10月在浙江工业大学举办一届红曲国际研讨会,从一个侧面映照出全球对红曲的关注。红曲所含的多种对人体具有重要保健作用的物质,对常捆扰现代人的多种慢性疾病(高胆固醇、高血压、高血糖、癌症及阿兹海默症等)均有预防与治疗的功效,可大幅降低文明病的发生。人们说21世纪是生物的时代,红曲霉这一菌物愈来愈受到国内外研究者的重视,可望形成一潜力巨大的红曲产业。

参考文献

[1] Tillakratne,N.J.K.,Mediana-Kauwe,K.,Gibson,K.M..4-aminobutyric acid(GABA) metabolish in mammalian neural and non-neural tissues. Coparative Biochemistry and Physiology,1995,112A:247~263。

[2] K.Tsuji,T.Ichikawa,M.Kawamura and Y.Nakagawa,Abstracts of Papers,The Annual Meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan,1986,4:216。

[3] Kohama,K., Matsumoto, S., Mimura, T., Tanabe, N., Inada, A. and Nakanishi, A. Isolation and identification of hypotensive principles in red-mold rice.Chem.Pharm.Bull,1987,35: 2484~2489。

[4] Tsuji,K.,Ichikawa, T., Tanable,N., Abe,S. and Nakagawa,Y. Antihypertensive activities of beni-koji extracts and γ-aminobutyric acid in spontaneously hypertensive rats.  Jpn. J. Nutr. 1992, 50:285~291。

[5] Inoue, K., Mukaiyama,Y., Tsuji,K.,Tanable,N., Tarui,S., Abe,S. and Takahashi,M.. Effect of beni-koji extracts on blood pressure in primary hypertensive volunteers. Jpn . J. Nutr., 1995, 53:263~271。

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