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红曲菌产Monacolin K和麦角甾醇的研究

作者:天曲生物 日期:2020-10-15 20:58:15 点击数:3

红曲菌产Monacolin K和麦角甾醇的研究

 

许赣荣1 朱效刚 1  张鑫1 刘义恩 2

 

1江南大学工业生物技术教育部重点实验室  无锡  214036 

2山东巨野巨彤生物工程有限公司  巨野  274933

 

  : 17株产麦角甾醇的红曲菌中,筛选到两株产Monacolin K较高的红曲菌99019908,经发酵工艺试验发现:二者以玉米渣作基本培养基,拌料水pH4.0时,9901菌以10 g/L酵母膏作氮源产Monacolin K和麦角甾醇分别为5.212.84 mg/g干曲,9908菌以10 g/L大豆粉作氮源产Monacolin K和麦角甾醇分别为10.023.01 mg/g干曲;另外,根据试验结果,对红曲菌产Monacolin K和麦角甾醇两者之间的关系提出了作者的见解。

 

关键词:红曲菌   莫那可林K  麦角甾醇 

 

 

Studies on the Monacolin K and Ergosterol Producted by Monascus

 

Xu Ganrong1,  Zhu Xiaogang1,   Zhang Xin 1,    Liu Yien2,     

 

(1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education, Southern Yangtze University, Wuxi 214036 China; 2.Shandong Juye Bright Red Biotech.Co.Ltd,Juye 274933  China  )

 

ABSTRACTTwo high-yielding Moncolin K and ergosterol strains,9901 and  9908 were screened from 17 strains of  Monascus.Their fermentation conditions were studied.The results showed that  the basic medium was corn lees for both of  them. The initial pH was 4.0.The contents of Moncolin K and ergosterol produced by Monascus 9901 were 5.21mg and  2.84mg every gram dry red rice when its nitrogen source was yeast extract. The contents of Moncolin K and ergosterol produced by Monascus 9908 were 10.02mg and 3.01mg every gram dry red rice when its nitrogen source was soybean power.Finally,we gived our own views on the relation between Moncolin K and ergosterol produced by Monascus.

 

Key wordsMonascus,    Monacolin K,    Ergosterol   

 

 

前言

红曲是我国的传统发酵产品,长期用于食品着色和酿酒,近年来,人们已经在红曲代谢产物中发现许多药理活性物质[1][2]可以降低胆固醇、预防和治疗胆结石,前列腺肥大及肿瘤,尤其是Monacolin类物质[7]以其降血脂作用成为众多科研工作者研究的热点。据报道[8]红曲菌含有较高的麦角甾醇(Ergosterol),它是脂溶性维生素D2的前体,经紫外线光化学反应生成维生素D2,对预防佝偻病、调节钙、磷的吸收有明显的生理作用。

目前,血脂偏高已经严重威胁着中老年人的身心健康,骨质疏松(Osteoporosis syndrome)在世界常见病、多发病中居第7位,所以对于我国特色的宝贵资源-红曲,我们应很好的开发利用。我们实验室已建立了功能性红曲中麦角甾醇的高效液相色谱测定方法,该方法与紫外分光光度法相比精确、灵敏。我们从实验室保藏菌株中筛选到两株不产桔霉素既高产Monacolin K又高产麦角甾醇的菌株99019908,并对其发酵条件以及产Monacolin K和麦角甾醇关系做了研究,以期为生产多功能性红曲做基础工作。

 

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种

实验室保藏菌种编号为:9901990299039906ZH4ZH5ZH6ZH11ZH12ZH2002ZKSZKOAWM951IMI2507659908SJS-34SJS-35

1.1.2培养基

斜面培养基:马铃薯培养基。

种子培养基(g/L):葡萄糖60,蛋白胨25NaNO3 2MgSO4•7H2O 1KH2PO4•3H2O 1pH 5.0

固态发酵培养基:称取100 g小米加入pH 4.0的拌料水60 mL装于1000 mL三角瓶中,棉塞封口,0.1 Mpa灭菌30min.

1.1.3主要试剂

标样麦角甾醇:sigma公司出品的标准样品;甲醇、乙醇、乙醚、蛋白胨、葡萄糖等均为国产分析纯级;高效液相用乙腈、甲醇等均为色谱纯级。

1.2 培养方法

PDA斜面上生长7 d的菌体刮两环接种到装有45 mL种子培养基的250 mL三角瓶中,往复式摇床(行程10 cm85 r/min)振荡, 30 培养44 h

固态发酵在1000 mL三角瓶中进行,装量100 g,种子液接种量45 mL,变温发酵18 d

1.3 测定方法

1.3.1麦角甾醇含量的测定

精密称取已烘干后的红曲样品0.50 g于比色管,加16 mL 25%的碱乙醇(25 g氢氧化钠用40 mL去离子水溶解,用无水乙醇定容至100 mL,8590 皂化1.5 h,补加4 mL乙醇继续皂化1 h,冷却至室温加10 mL乙醚,振荡30 s,静置提取30 min;水洗至中性,将乙醚全部蒸干,用乙醇定容25 mL

高效液相色谱仪:Angilent 1100系列;色谱柱:ZORBAX Eclipse SB-C185 μm 250 mm×4.6 mm);柱温:30;流动相:甲醇;流速:1.0 ml/min;检测器:紫外可见光分光光度检测器;检测波长:284.0 nm;进样量:10 μL;处理后的样品溶液经0.45 μm偏氟膜微滤,用HPLC测定。

1.3.2Monacolin K含量的测定

高效液相色谱法[10]

1.3.3桔霉素含量的测定

高效液相色谱法[11]

 

2结果及讨论

2.1 实验室保藏菌株的筛选

17株待试红曲菌株经种子培养后,接到固态培养基中培养,发酵结束的红曲米烘干后测定麦角甾醇、Monacolin K及桔霉素的含量,见表1。筛选出两株不产桔霉素既高产Monacolin K又高产麦角甾醇的菌株99019908,本文进一步研究了发酵条件对其产Monacolin K和麦角甾醇的影响。

 

 1 17株红曲菌产麦角甾醇、Monacolin K及桔霉素能力的比较

菌种编号

麦角甾醇含量

/mg·g-1干曲

Monacolin K含量

/mg·g-1干曲

桔霉素含量

/mg·kg-1干曲

9901

3.06

3.64

0

9902

2.61

0.05

1369.30

9903

2.49

2.50

9.74

9906

1.26

1.33

0

ZH4

3.15

0.11

8.80

ZH5

1.99

0

0

ZH6

3.10

0.02

524.22

ZH11

2.78

0.13

2.79

ZH12

2.09

0.05

0

ZH2002

2.39

0.09

0

ZKS

2.38

0.02

2.34

ZKOA

3.26

0.12

796.15

WM951

2.30

0.28

9.10

IMI250765

3.19

0

26.01

sjs-34

1.77

1.42

15.63

sjs-35

2.03

0.19

0

9908

3.24

5.78

0

 

2.2 基本培养基对产Monacolin K和麦角甾醇的影响

选用籼米、小米、玉米渣、小麦为不同基本培养基,其它发酵条件相同,发酵结束测定发酵物中Monacolin K和麦角甾醇含量,由表2和表3可见,两株菌株以玉米为基本培养基时产Monacolin K能力最强,而且其中酸式Monacolin K的含量也较高,麦角甾醇的含量相对其它原料较低都约为3.1 mg/g干曲。       

 

 2 基本培养基对9901Monacolin K和麦角甾醇的影响(单位:mg/g干曲)


小米

籼米

玉米

小麦

MK含量

3.49

4.4

4.58

3.04

酸式MK含量

2.45

2.86

3.18

2.38

Erosterol含量

3.77

3.31

3.17

3.38

       

 3 基本培养基对9908Monacolin K和麦角甾醇的影响(单位:mg/g干曲)


小米

籼米

玉米

小麦

MK含量

6.94

6.44

9.20

4.46

酸式MK含量

3.04

3.67

4.71

3.83

Erosterol含量

3.81

3.68

3.12

3.54

 

2.3 拌料水初始pH对产Monacolin K和麦角甾醇的影响

通过液态发酵实验得出,红曲菌耐酸性很强。设定pH范围为2.56进行试验,由图1、图2可知,99019908在酸性环境条件下都很好的生长,且在pH 4.0时产Monacolin K最高,此时麦角甾醇的含量相对其它pH时较低。

 

                        

1 pH9901Monacolin K                     2 pH9908Monacolin K

和麦角甾醇的影响                                          麦角甾醇的影响

 

2.4 外加氮源对产Monacolin K和麦角甾醇的影响

以玉米为基本培养基,添加大豆粉,蛋白胨,酵母膏, NaNO3,NH4NO3不同氮源进行试验。如图3和图4所示,两者以有机氮源比无机氮源效果好,Monacolin K的产量较高,9901菌以10 g/L酵母膏作氮源Monacolin K和麦角甾醇分别为5.212.84 mg/g干曲 9908菌以10 g/L大豆粉作氮源Monacolin K和麦角甾醇分别为10.023.01 mg/g干曲;另外,两株菌株在产Monacolin K较高时,麦角甾醇相对产量较低。

 

 

         3氮源对9901Monacolin K            4氮源对9908Monacolin K

麦角甾醇的影响                                            麦角甾醇的影响

 

2.5 红曲菌产Monacolin K和麦角甾醇关系的探讨

从以上99019908这两株红曲菌的发酵试验,我们发现它们在某一条件下产Monacolin K较高时,产麦角甾醇相对较低。这种现象我们可以从胆固醇和麦角甾醇的生物合成途径中得到解释,在胆固醇的合成途径[6]( 5)中,HMG-CoA还原酶是控制合成速度的关键酶,红曲中的Monacolin类化合物是一类天然的HMG-CoA还原酶抑制剂,因此能显著抑制体内胆固醇的合成。 


乙酸盐→乙酰CoA→乙酸乙酰CoA→甲羟戊二酰CoA

  nbsp;                                                                                    (HMG-CoA)

 

HMG-CoA还原酶

 

羊毛甾醇←鲨烯←5-磷酸甲羟戊酸内酯←甲羟戊酸内酯

                                      ↓

2,4脱氢胆固醇→胆固醇

 

 5  胆固醇生物合成途径

 

国外一些学者[3][4]对麦角甾醇产生菌及其合成代谢途径[5][9](图6)进行了比较深入的研究,大多数认为麦角甾醇的合成是一个多酶参与的复杂代谢过程,HMG-CoA 还原酶也是控制麦角甾醇合成的限速酶。所以理论上如果红曲菌产Monacolin K的能力高的话,它势必也会抑制麦角甾醇合成的限速酶HMG-CoA还原酶,从而抑制麦角甾醇的合成。

乙酰辅酶A+H2O   羟甲基戊二酰辅酶A     HMG-CoA 还原酶

亮氨酸                         HMG-CoA                 NADPH+2H+

二羟甲基戊酸(MVA角鲨烯 羊毛甾醇 酵母甾醇

 

24位甲基化     类甾醇     2223位双键       麦角甾醇    反馈抑制

 

 6  麦角甾醇生物合成途径

 

2.6 红曲菌产Monacolin K和麦角甾醇关系的验证

我们选取实验室保藏的另一株红曲菌SJS-34,对其进行了高产Monacolin K发酵工艺的优化。在未优化时红曲菌SJS-34Monacolin K和麦角甾醇分别为1.421.77mg/g干曲,在优化的发酵条件下产Monakolin K达到5.18 mg/g干曲,麦角甾醇的含量却降低为0.51 mg/g干曲。另外,从表 1:红曲菌9901在未优化时产Monacolin K和麦角甾醇分别为3.643.06mg/g干曲,经优化以后它产Monacolin K和麦角甾醇分别为5.212.84 mg/g干曲;红曲菌9908在未优化时产Monacolin K和麦角甾醇分别为5.783.24mg/g干曲,经发酵优化以后它产Monacolin K和麦角甾醇分别为10.023.01 mg/g干曲。这些实验结果再一次验证了2.5红曲菌产Monacolin K和麦角甾醇关系的推论:红曲菌Monacolin K较高时,产麦角甾醇相对较低。

 

3 结论

从实验室保藏的菌株中筛选到两株产Monacolin K和麦角甾醇能力较高的红曲菌99019908,发酵优化的培养基为:以玉米渣作基本培养基,拌料水pH4.09901菌以10 g/L酵母膏作氮源产Monacolin K和麦角甾醇分别为5.212.84 mg/g干曲,9908菌以10g/L大豆粉作氮源产Monacolin K和麦角甾醇分别为10.023.01 mg/g干曲;另外,从试验中发现红曲菌在某一发酵条件产Monacolin K 较高时,产麦角甾醇相对较低,这与其生物合成途径相吻合。

 

 

 

参考文献

[1]Endo.A.Monacolin K,a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species.J.Antibiotics,1979,34:852~854

[2]Chang L., Yan Z., Yin Y. W. et al. Monascus purpureus-fermented rice (red yeast rice): A natural food product that lowers blood cholesterol in animal models of hypercholesterolemia [J]. Nutrition Research, 1998, 18(1): 71~81.

[3]Newell S Y et al.App Envir Microbiol,1988,54(7):1876~1879.

[4]Servouse M et al.J Biochem,1986,240:541~547.

[5]Inoue T,Iefuji H,Fujii T et al.Biosci Biotechnol Biochem,2000,64(2):229~236.

[6]欧阳曙,朱宝泉,龚炳永.胆固醇生物合成酶抑制剂-抗生素SIPI-89-17-的研究.中国抗生素杂志,1998182):128~135

[7]陈晔,朱华,许赣荣.红曲霉9901液态发酵产莫那可林K的发酵条件.食品与发酵工业,200430(1):57~61

[8]陈松生,毛宁,陈哲超等.红曲霉的麦角固醇研究.食品与发酵工业, 1995, No.618~23

[9]邓玉清,王纪,虞龙.微生物麦角甾醇的研究进展,微生物学杂志,2001213):45~47

[10]朱华,许赣荣,陈蕴,HPLC法测定红曲中酸型与内酯型Monacolin K 含量.无锡轻工大学学报,2003223):46~52

[11] 蕴,许赣荣,虞慧玲.红曲桔霉素高效液相色谱测定条件的优化.食品与发酵工业,2004301):118~123

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