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红曲霉壳聚糖制备

作者:天曲生物 日期:2020-10-15 20:59:44 点击数:5

红曲霉壳聚糖制备

 

  陈旭峰1   周立平2

 

1金华职业技术学院生物工程学院  金华  321000

2 浙江工业大学生物与环境工程学院 杭州 310032

 

摘要:本文主要探讨了从红曲霉培养物中提取壳聚糖的提取工艺路线,并应用于综合利用红曲霉废菌体提取壳聚糖试验。首先通过实验优化了酸碱脱蛋白工艺条件、脱色工艺以及脱乙酰化工艺,确定了红曲霉壳聚糖的提取工艺路线:干燥菌体磨碎除蛋白质(先用2%HCl、沸水、固液比1:6,处理1h,离心洗涤;再用15%NaOH溶液、沸水、固液比1:6,处理1h)→离心过滤洗涤(至中性)脱色处理(10%的双氧水溶液(固液比采用1:2080水浴1h酸碱不溶物干燥脱乙酰化制备壳聚糖(碱浓度CNaOH50%、处理温度130、处理时间3h、固液比1:4离心洗涤过滤醋酸浸提(2%乙酸浸提)沉淀(用20%NaOH调节滤液的pH值至9沉淀物干燥壳聚糖。

其次对红曲霉废菌体进行了提取壳聚糖试验,提取红曲色素后的红曲米中制备壳聚糖的得率为1.32%,提取红曲色素后液体发酵红曲霉菌丝体制备壳聚糖得率5.37%

 

关键词:红曲霉  壳聚糖  甲壳素

 

 

The preparation of chitosan by fermenting monascus spp.

 

Chen Xufeng1  Zhou Liping2

 

1 College of Biological Engineering  Jinhua Professional Technical College  Jinhua  321000

( 2 College of Biological and Environmental Engineering   Zhejiang University of Technology   Hangzhou  310014 )

 

 

Abstract:The extracting chitosan processing routine from monascus spp.was studied in the paper,and the experiments on extracting chitosan from waste monascsu spp.was studied. Above all,the processing conditions of crashing cell and wiping protein,decolor,taking off acetyl in mycelia cell wall was studied,the optimal extracting processing routine was as follow:thallus→crush up→crashing cell and wiping protein(firstly 2% HCl,temperature 100,ratio of solid and liquid 1:6,disposing time 1h,centrifugal filtration, secondly 15%NaOH,temperature 100,ratio of solid and liquid 1:6,disposing time 1h)→centrifugal→filtration and washing to pH7.0 →decolor(10%H2O2 liquor(ratio of solid and liquid 1:20),80,1h)→not dissolve substance→drying→taking off acetyl(alkali concentration CNaOH50%,temperature 130,ratio of solid and liquid 1:4,disposing time 3h)→centrifugal→filtration and washing to pH7.0→taking up(2%acetic acid)→deposition(20%NaOH adjust to liquor’s pH 9.0)→not dissolve substance→dryness→chitosan. Secondly,the experiments on extracting chtiosan from the waste monascus spp.,the yield ratio for extracting chitosan from hongqu rice that had extracted hongqu pigments was 1.32%,the yield ratio for extracting chitosan from monascus spp. Mycilium that had extracted hongqu pigments was 5.37%.

 

Keywords: monascus spp. Chitosan chitin

 

 

1前言

    在红曲霉菌丝体中,甲壳素占细胞壁干重的20%~40%,和葡聚糖约占红曲霉菌丝体细胞壁干重的80~90%,除此之外,细胞壁中还有半纤维素、纤维素、半乳甘露聚糖、半乳糖胺、蛋白质、脂类以及色素等物质。因此从菌丝体中获得菌丝体细胞壁的关键是将菌丝体所含蛋白质、脂类、有机酸、多元醇和其它水溶性糖类去除。甲壳素和葡聚糖相互交织在一起形成红曲霉菌丝体坚固的细胞壁,因此两者不能用简单的机械分离方法进行有效的分离;其中还混有少量的纤维素。制备壳聚糖过程中,菌体蛋白质是否脱得干净对壳聚糖的产率及脱乙酰度都非常关键。如果蛋白质没有脱净,在用浓碱脱乙酰化过程中,逐渐形成的自由氨基,对蛋白质有很强的吸附作用[1],使其表层形成一层保护层,阻碍碱的脱乙酰基作用,使脱乙酰度不高,并影响壳聚糖的纯度。

红曲霉菌丝体细胞壁制备后需进行脱乙酰化处理才能得到壳聚糖,并且去除交联在一起的葡聚糖。目前广泛使用的脱乙酰化方法是用浓NaOH溶液处理甲壳素,制备分子量较高的壳聚糖的碱液法,在此方法中,脱乙酰基的速度与碱液浓度、温度、反应时间有密切的关系,碱液的浓度不能低于30%,且反应温度与脱乙酰速率成正比,在较低温度长时间或高温短时间反应可生产高粘度的壳聚糖。

 

2材料与方法

2.1菌种

Monascus purureus Went SM001(浙江工业大学红曲研究课题组保存)

 

2.2提取红曲色素后的红曲米

义乌丹溪酒业有限公司提供

 

2.3 提取红曲色素后液体发酵红曲霉菌丝体

广东江门科隆生物技术有限公司提供

 

2.4培养基及培养方法

2.4.1 培养基

斜面培养基12~14°BX麦芽汁,用乳酸调节pH值至4.5~5.0,加2%琼脂。

种子培养基4%葡萄糖2%蛋白胨0.2%NaNO30.1%KH2PO40.1%MgSO4·7H2O乳酸调pH4.0

发酵培养基4%葡萄糖2%蛋白胨0.2%NaNO30.1%KH2PO40.1%MgSO4·7H2O冰醋酸调pH4.0

以上培养基在0.1MPa121灭菌锅内消毒30min

 

2.4.2 培养方法

斜面培养:自冰箱取出菌种32下斜面培养5d活化一次后,然后转接试管斜面置32恒温培养7~10d

种子培养:已培养好的新鲜斜面菌种,用接种针将斜面培养基连同菌丝体划破成小块直接接入装有100ml培养液的500ml摇瓶中,置32200rpm摇床培养24h左右,瓶壁上粘有少量菌丝,菌液呈微红色,无异味,镜检无杂菌。

摇瓶发酵培养:将培养好的种子液按8%的接种量接种于装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中,置32200rpm的摇床上培养36h

 

2.5 分析方法

2.5.1 菌体鲜重的测定:发酵液5000rpm离心20min后,蒸馏水洗涤至中性,称重即为菌体鲜重(g)

2.5.2 菌体干重的测定:鲜菌体置60烘箱干燥6h,取出称重(g)

2.5.3 蛋白质溶出物占菌丝体干重质量百分比的测定

2.5.3.1 蛋白质溶出物浓度(C蛋白质)的测定[2]

2.5.3. 2 蛋白质溶出物占菌丝体干重质量百分比的测定

菌丝体经盐酸或氢氧化钠溶液处理后,取溶液适当稀释,测定其中蛋白质溶出物浓度,计算。

Y蛋白质

C蛋白质×nV

×100

Wm

 

式中:Y蛋白质为蛋白质溶出物占干菌丝含量(%);

          C蛋白质为蛋白质溶出物浓度(mg/ml);

          n为稀释倍数;

          V为原溶液总体积(ml);

          Wm为菌丝体干重(g)。

 

2.5.4  壳聚糖得率的测定

Ychitosan(%)

Wchitosan

×100%

W细胞壁干重

 

式中:Ychitosan(%)为壳聚糖得率

          Wchitosan为红曲霉菌丝体细胞壁干重

 

2.5.5  壳聚糖纯度的测定[3]

2.5.6 脱乙酰度的测定

紫外光谱法[4]

2.5.7 粘度测定

NDJ1型旋转式粘度计测定5

2.5.8 壳聚糖分子量的测定

粘度法[6]

 

3结果与讨论

3.1 酸碱破壁脱蛋白工艺研究

从工业化和常用细胞破壁方法等方面考虑,选择经济、简便、易于工业化的酸或碱化学破壁法。在保证蛋白质等物质的去除效果的条件下,以菌丝体细胞壁的得率Y蛋白质(%)为指标做一系列正交试验,以确定较优的工艺条件。

3.1.1 碱法破碎红曲霉菌丝体细胞壁脱蛋白的研究

碱浓度、固液比、温度、加热时间均是影响细胞壁破碎程度的因素。为了量化细胞壁破碎程度本实验采用以红曲霉菌丝体中的蛋白质的溶出物占菌丝体含量(以下简称蛋白质含量Y蛋白质())为指标,采用四因素三水平,选择L934)正交表。

实验方案和实验结果见表1和图1

 

1 碱法破壁脱蛋白正交试验因素水平表

        因素

水平 

A:碱浓度

CNaOH(%)

B:固液比

W/V

C:处理温度

D:处理时间

h

1

10

1 : 4

60

1

2

15

1 : 6

80

1.5

3

20

1 : 8

100

2

 

 

结果可见,极差RCRBRARD,说明碱处理过程中,处理的温度对蛋白质溶出率Y蛋白质的影响最大,固液比次之,碱浓度更次之,处理时间影响最小。由此试验可确定较优的碱处理工艺为A2B3C3D3即:15%NaOH、固液比1:8 处理温度100、处理时间2h。进行验证,得到Y蛋白质3.48%。经过最佳碱法脱蛋白工艺条件处理的红曲霉菌丝体固体质量是处理前的52.3%

 

3.1.2 酸法破碎红曲霉菌丝体细胞壁脱蛋白的研究

在碱法破壁脱蛋白试验的基础上,对酸法破壁脱蛋白的工艺也进行了初步的研究,比较酸法与碱法的优劣。与碱法破壁的影响因素相同,酸法也采用稀盐酸的浓度、处理时间、固液比和处理温度为试验影响因素, Y蛋白质为指标做正交试验,确定较优的工艺条件。试验采用四因素三水平的正交表。采用极差(R)分析试验的结果,实验方案和实验结果见表2和图2

 

2 酸法破壁脱蛋白正交试验因素水平表

        因素

水平 

A:酸浓度

CHCl%

B:固液比

W/V

C:处理温度

D:处理时间

h

1

1

1 : 4

60

1

2

2

1 : 6

80

1.5

3

3

1 : 8

100

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

结果可以看出:RCRDRARB,说明酸处理过程中,酸处理的温度对Y蛋白质的影响最大,处理时间次之,固液比和酸浓度的影响最小。因此较优的工艺条件为A3 B2 C3 D23%HCl、固液比1:6处理温度100、处理时间1.5h。进行验证,结果为:Y蛋白质3.54%。从试验结果看酸处理效果比碱处理稍好,而且酸处理时间和酸浓度都比碱处理工艺中的碱处理时间和碱浓度小,因此酸法破壁比碱法更具优势。经过经过最佳酸法脱蛋白工艺条件处理的红曲霉菌丝体固体质量是处理前的44.6%

 

3.1.3 酸碱交替法破碎红曲霉菌丝体细胞壁脱蛋白的研究

菌丝体中除了蛋白质之外,还有非几丁质糖类、核酸、无机盐等杂质需要脱除,出于工业化生产的考虑,本文对经济、简便、易于工业化大生产的酸/碱化学破壁脱蛋白法也进行了研究。采用以红曲霉菌丝体中的蛋白质的溶出物占菌丝体含量(以下简称蛋白质含量Y蛋白质(%))为指标;碱浓度、固液比、温度、加热时间均是影响脱蛋白效果的因素,温度在100下,采用碱浓度、稀盐酸的浓度、处理时间、固液比和处理温度为试验影响因素, Y蛋白质为指标做正交试验,确定较优的工艺条件。

 

3 酸碱交替法破壁脱蛋白正交试验因素水平表

     因素

水平     

A:碱浓度

CNaOH%

B:酸浓度

CHCl%

C:酸碱处理顺序

D:处理时间(min

E:固液比(W/V

1

5

1

先酸后碱

30+30

1 : 6

2

10

2

先碱后酸

60+60

1 : 3

3

15





4

20





    

 

如图3所示,在酸碱交替法脱蛋白试验中,酸碱处理顺序的影响最大,其次是碱浓度,再次是处理时间,酸浓度和固液比的影响最小。其较优的工艺条件为A3 B2 C1 D2E1即:15%NaOH2%HCl、先酸后碱处理、处理时间酸碱各1h、固液比均为1 : 6。进行验证,结果为:Y蛋白质3.92%。从处理的效果看,酸碱交替法脱蛋白比简单用碱或酸处理的效果好很多。而且在此过程中不但去除了蛋白质,其他非几丁质糖类、核酸、无机盐等杂质也进行了脱除。先碱后酸比先酸后碱处理溶出的蛋白质效果更好,原因可能是由于酸能够溶解膜中的脂类,从而有利于细胞破碎和胞内物质的外溢。经过经过最佳酸碱交替法脱蛋白工艺条件处理的红曲霉菌丝体固体质量是处理前的45.2%

 

3.2菌丝体细胞壁脱色

虽然经过酸碱交替法破壁脱蛋白工序的处理,菌丝体中仍然含有大量的次级代谢产生的红曲红色素、黄色素。色素常与真菌甲壳素结合形成复合物,不易清除。为了进一步减少菌丝体中杂质含量、改善菌丝体色泽,有必要对菌丝体进行脱色处理。现在甲壳素生产过程中,大多采用高锰酸钾和过氧化氢进行脱色处理。高锰酸钾进行脱色时要使用亚硫酸钠进行还原,产生有毒的二氧化硫气体,对人体有极大的危害。所以本实验采用双氧水进行脱色,利用双氧水进行脱色时不需要加入其它还原剂,而且在对菌丝体进行过滤、洗涤时也不会产生污染性废水。经过试验确定10%的双氧水溶液(固液比采用1 : 2080水浴1h

3.3碱法脱乙酰制备壳聚糖的研究

本文对红曲霉制备的菌丝体细胞壁进行脱乙酰化工艺研究,探讨其脱乙酰化适宜的反应条件。

3.3.1 碱法脱乙酰制备壳聚糖的正交试验

以壳聚糖得率(Ychitosan(%))为主要指标,壳聚糖脱乙酰度D.D.(%)为辅助指标对影响因素碱浓度CNaOH、处理温度t、固液比W/V、处理时间τ作正交试验,以确定制备壳聚糖的较优工艺条件。采用L934)正交表,采用极差分析法分析试验结果。试验方案结果见表45

 

4 碱法脱乙酰正交试验因素水平表

     因素

水平

A:碱浓度CNaOH()

B:固液比

(W/V)

C:处理温度

()

D:处理时间

(h)

1

45

1 : 4

80

1

2

50

1 : 6

100

2

3

55

1 : 8

121

3

 

5 碱法脱乙酰正交优化试验结果表

   因素

 

试验号

A:碱浓度CNaOH(%)

B:处理温度

()

C:固液比

(W/V)

D:处理时间(h)

Ychitosan

()

D.D.

(%)

1

145

1(80)

1(1 : 4)

1(1)

9.35    

81.6

2

1

2(100)

2(1 : 6)

2(2)

11.02

82.5

3

1

3(121)

3(1 : 8)

3(3)

11.85

85.0

4

250

1

2

3

10.30

83.1

5

2

2

3

1

9.81

85.5

6

2

3

1

2

12.30

86.6

7

355

1

3

2

9.98

85.3

8

3

2

1

3

11.20

89.3

9

3

3

2

1

10.56

88.4

K1

32.22

29.63

32.85

29.72


K2

32.41

32.03

32.50

33.30

K3

31.74

34.71

31.64

35.15

k1

10.74

9.88

10.95

9.91

k2

10.80

10.68

10.83

11.10

k3

10.58

11.57

10.55

11.72

R

0.22

1.69

0.40

1.81

较优水平

A2

B3

C1

D3

影响的主次顺序

DBCA

由表5:极差RDRBRCRA,说明处理时间的指标对Ychitosan影响最大,处理温度次之,固液比更次之,碱浓度的影响最小。为此确定的较优工艺A2 B3 C1 D3即:碱浓度50%、处理时间130、固液比1 : 4、处理时间3h,试验验证其Ychitosan14.50%、脱乙酰度D.D.(%)89.5

 

3.3.2 碱法脱乙酰制备壳聚糖的单因素试验

从正交试验中可以看出,壳聚糖的产率随着反应时间的增长和反应温度的升高呈增长趋势。所以分别做Ychitosan随时间和温度变化的单因素试验,同时考虑到壳聚糖分子链的降解,由于粘度能表征壳聚糖分子量的大小并且容易测定,所以也分别作了对壳聚糖乙酸溶液的粘度η随时间和温度的变化的曲线。

 

1) 处理时间对壳聚糖产率和粘度的影响

在温度120、碱浓度50%、固液比为1 : 4的情况下,我们进行处理时间对Ychitosan和粘度的影响试验。试验结果见图4

 

 

由图4可以看出,产率随时间的延长呈二次曲线,在3.0小时达到最大值。同时粘度随时间的延长不断减小,但是减小幅度并不是很大,对产品质量影响并不是很大。若无特殊要求,主要考虑得率的因素。

 

2) 处理温度对壳聚糖和粘度的影响

在处理时间3h、碱浓度50%、固液比为1 : 4的情况下,我们进行处理温度对Ychitosan和粘度的影响试验。试验结果见图5

由图5所示,壳聚糖产率随温度的升高,达到一定限度以后不再上升;但壳聚糖粘度随着温度的升高不断的下降,说明温度升高到130以后,甲壳素基本上转化为壳聚糖,所以壳聚糖产率不再上升,而粘度却随着温度的上升不断下降,也就是壳聚糖的分子量不断的减小。由于粘度降低的幅度不是很大,脱乙酰化适宜温度在130左右为

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

由碱法脱乙酰正交试验以及时间和温度的单因素试验可知脱乙酰化较优的条件为:碱浓度CNaOH50%、处理温度130、处理时间3h、固液比1 : 6;其壳聚糖得率为14.5%,脱乙酰度89.5%。测定其粘度为5.58mpa·s、粘均分子量为1.43×105、纯度为84.7%

 

3. 4 结论

上述实验确定了红曲霉壳聚糖的提取较优的工艺路线:干燥菌体磨碎除蛋白质(先用2%HCl、沸水、固液比1 : 6,处理1h,离心洗涤;再用15%NaOH溶液、沸水、固液比1 : 6,处理1h)→离心过滤洗涤(至中性)脱色处理(10%的双氧水溶液(固液比采用1 : 2080水浴1h酸碱不溶物干燥脱乙酰化制备壳聚糖(碱浓度CNaOH50%、处理温度130、处理时间3h、固液比1 : 4离心洗涤过滤醋酸浸提(2%乙酸浸提)沉淀(用20%NaOH调节滤液的pH值至9沉淀物干燥壳聚糖。

 

3.5 废菌体提取壳聚糖试验

应用上述提取工艺路线对提取红曲色素后的红曲米滤渣和提取红曲色素后液体发酵红曲霉菌丝体进行提取试验。

经提取红曲色素后的红曲米滤渣过脱蛋白处理后的红曲霉细胞壁成分占滤渣的32.5%,每100g滤渣经过整个提取过程后制得壳聚糖1.32g

提取红曲色素后液体发酵红曲霉菌丝体经过脱蛋白处理后的红曲霉细胞壁成分占滤渣的34.8%,每100g菌体经提取壳聚糖5.37g

 

参考文献

[1] Knorr D. Food Technol 1991,45:114

[2]李建武、肖能赓、余瑞元、袁明秀等.生物化学实验原理和方法.北京:北京大学出版社.1994.171~173

[3]朱晓兰.甲壳素/壳聚糖纯度测定的研究.江南大学硕士论文.2002.39

[4] Muzzarelli R A A,Rocchetti R.Carbohydr.Polym.1985,(5):461

[5] 郑连英,姚恕,刘茉娥.壳聚糖的质量分析和标准.精细化工,1993,10(1)16~18

[6] 费文丽,钟耀荣. 甲壳素系产品的分析方法.化工矿物与加工,2001827~29.

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