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红曲提取分离液抑菌性的初步研究

作者:天曲生物 日期:2020-10-15 21:03:42 点击数:8

红曲提取分离液抑菌性的初步研究


赵树欣 宫慧梅


(天津科技大学生物工程学院 天津 300222)


摘要:采用不同性质的溶剂提取红曲样品,做抑菌试验,结果表明红曲的水提取液、70%乙醇提取液、95%乙醇提取液、乙酸乙脂提取液等都有不同程度的抑菌作用。但不同提取溶剂的提取物对同一种微生物抑菌效果有差异;同一种溶剂提取物对不同种类微生物的抑菌效果也不同。总的说来,水溶性成份和70%乙醇提取液的抑菌效果要更显著。

为了进一步了解抑菌成分,我们对红曲70%乙醇提取液进行了层析分离。红曲色素经硅胶柱分离后形成红、橙、黄三条色带。用正己烷-乙酸乙酯洗脱黄色部分;乙酸乙酯洗脱橙色部分;甲醇-乙酸乙酯洗脱红色部分。为了解三种组分的纯度,分别对红色组分、橙色组分和黄色组分作了薄层层析。经层析分离后黄色组分走出一个黄色斑点和一个荧光点;橙色组分只有一个橙色斑点;红色组分呈现一个红色斑点和一个荧光点。

分别对以上三种组分的抑菌性进行了研究。供试菌为蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和青霉。结果表明,橙色组分对三种细菌具有很强的抑菌作用,但对酿酒酵母和青霉的生长没有抑制作用。而红色组分和黄色组分则对所有供试菌都基本没有抑制作用。


关键词:红曲霉  提取液  抑菌性


前言

在中国古代的文献中就有关于红曲具有抑菌作用的记载。1977年香港的Wang HC等发现了一种起抑菌作用的物质命名为Monascidin A.。1995年法国的Blanc等实验证明Monascidin A就是橘霉素。国内近十年也有不少研究红曲抑菌性的论文发表。如董明盛等对发酵液、红曲粉的抑菌性作了研究;童群义等用液态发酵生产的红色素作了抑菌性研究。但是对于起抑菌作用的物质的性质仍然了解很少。我们研究室也对这个问题进行了初步研究。


1材料与方法


1.1材料

1.1.1供试微生物由天津科技大学菌种保藏室提供

1.1.2供试样品市购

1.1.3所用试剂均为分析纯


1.2方法

1.2.1红曲提取液的制备:准确称取红曲样品1g,分别加入20ml的 70%乙醇、95%乙醇、蒸馏水、乙酸乙酯提取制得。

1.2.2红曲色素分离液制备:将70%乙醇的红曲提取液上硅胶柱分离,形成红、橙、黄三条色带,然后依次洗脱。黄色组分用正己烷:乙酸乙酯洗脱,橙色组分用乙酸乙酯洗脱;红色组分用乙酸乙酯:甲醇洗脱。分别收集分离的黄、橙、红三种组分。

三种组分分别进行薄层层析法展开,观察展开效果。刮取薄板上的展开点,进行扫描。

1.2.3抑菌实验


滤纸片法

a. 将滤纸用打孔机打好,直径为6mm左右。与清洗后的试管、培养皿、吸管一起进行干热灭菌,条件为140℃维持2h。

b..将培养8小时的实验菌株,用无菌水制成含菌数为105个/ml的菌悬液。

取0.5ml的菌液放入相应的平板上,用无菌的涂布器涂布均匀。

c. 将干热灭菌后的滤纸片放入无菌平皿中(每个平皿30片左右),向平皿中加入红曲提取液,浸泡30分钟,加入量以没过滤纸片为宜。取出滤纸片,在40℃条件下干燥15min左右。待滤纸片完全干燥后,从干燥器中取出滤纸片,备用。整个过程要注意无菌操作。

将干燥后的滤纸片,贴到已涂布好菌液的平板上,每个平板贴3-4个滤纸片,每个处理重复3次。细菌置37℃培养24小时,酵母菌28℃培养48小时,霉菌置28℃培养3天。测抑菌圈。


管碟法

管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法,主要步骤为:

a.倒底层平板,需要注意的是应选择操作台面的水平位置。操作时需要将融化、灭菌后的培养基,在室温下冷却至60℃左右,然后再倾注到平板上,避免有冷凝水产生;

b.将无菌牛津杯按照一定的顺序摆放在底层平板上;

c.取灭过菌的半固体培养基,在室温下冷却至40℃左右。吸取0.2ml菌数为105个/ml的稀释菌悬液,加入到半固体培养基中,吹吸数次,使菌液与培养基混匀;

d.迅速将混匀的培养基倒入放有牛津杯的底层培养基上,立即摇匀,但应避免产生气泡;

e.半固体培养基完全凝固后,小心的取出牛津杯,应避免带出培养基;

f.用加样枪向孔穴处加入一定量的红曲提取液,放置于培养箱中培养12小时;

g.观察、测量抑菌圈。


                                               加样处



图1管碟法示意图


2结果


2.1不同红曲样品提取液的抑菌性

按以上方法对不同红曲样品提取液的抑菌性进行了检测,结果如下:

 

 1  红曲粉样品的抑菌能力

         提取液

菌种

水溶液

70%乙醇

95%乙醇

乙酸乙酯

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

蜡样芽孢杆菌

++

++

++

++

++

++

+

+

+

+

+

+

金黄葡萄球菌

++

+

+

++

++

++

+

-

+

+

-

+

枯草芽孢杆菌

+

+++

++

+

++

++

+

+

+

+

+

+

短小芽孢杆菌

+

++

+

++

+

++

-

+

-

+

-

-

大肠杆菌

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

伤寒沙门氏菌

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

啤酒酵母

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

卡尔斯伯酵母

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

异常汉逊酵母

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

黑曲霉

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

青霉

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

黄曲霉

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

 

 

采用相同的方法对红曲红样品的抑菌能力也进行了研究,结果见表2

 

红曲红样品的抑菌能力

  试剂

菌种

乙醇70%

乙醇95%

乙酸乙酯

蒸馏水

1

2

1

2

1

2

1

2

蜡样

+++

++++

+

+

+

+

+++

+++

金黄色

++

+++

+

-

+

+

++

+++

枯草

+++

++++

+

+

+

-

+++

++

短小

++

+++

+

+

+

+

++

++

大肠

+

+

-

-

-

-

+

+

伤寒沙门氏菌

-

+

-

-

-

-

+

+

汉逊

-

-

-

-

-

-

-

-

啤酒

-

-

-

-

-

-

-

-

卡尔

-

-

-

-

-

-

-

-

黄曲霉

-

-

-

-

-

-

-

-

黑曲霉

-

-

-

-

-

-

-

-

青霉

-

-

-

-

-

-

-

-



从以上结果可知,70%乙醇提取液和水提取液有较好的抑菌效果。为了了解各种提取液对不同组分的提取效果,分别检测了各提取液在505 nm 、470 nm和410nm下的吸光值。结果如下:


 

3  四种提取液的提取效果

     吸光度

样品


505nm

470nm桔黄

410nm

红曲粉1

水溶

14.3

12.7

21

70%乙醇

440

226

480

乙酸乙酯

107.6

95.6

223.6

95%乙醇

230

175

241

红曲粉2

水溶

13.5

11.4

14

70%乙醇

320

213

350

乙酸乙酯

14.2

15.4

12

95%乙醇

304

105

184

红曲粉3

水溶

17

14.2

19

70%乙醇

290

220

274

乙酸乙酯

101.6

91.2

143.6

95%乙醇

172

98.7

102.4

红曲粉4

水溶

14.1

10.4

12.5

70%乙醇

326

246

280

乙酸乙酯

104

182

126

95%乙醇

236

108

168

红曲红1

水溶

2735

1835

2150

70%乙醇

4520

2010

2950

乙酸乙酯

102

88.8

205.6

95%乙醇

2432

1484

1340

红曲红2

水溶

1020

680

820

70%乙醇

1650

880

1140

乙酸乙酯

41.6

22

39.6

95%乙醇

945

573

679


从上表可知,以上四种提取溶剂相比,70%乙醇对各组分的提取效果都比较好,无疑是最佳的提取溶剂。四种溶剂对红曲红样品的提取效果,按照70%乙醇、水溶液、95%乙醇、乙酸乙酯的顺序依次递减;对于红曲粉样品,由强至弱的提取顺序为70%乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯、水溶液。


2.2 分离液的抑菌性

2.2.1分离液的性质,按上述方法制得的三种色素分离液,旋转薄膜浓缩至干,70%乙醇定容至1ml。为鉴定分离液的纯度,将获得的色素利用薄层层析法进行展开分离。其中黄色组分用正己烷:乙酸乙酯展开,出现一个黄色斑点和一个荧光点;橙色组分用乙酸乙酯进行展开,只呈现一个桔黄色斑点;红色组分用甲醇:水展开后,呈现一个红色斑点和一个桔黄色斑点。

刮取薄层上分离得到的黄色、桔黄色和红色斑点,加入70%乙醇多次溶解、离心、分离,收集三种分离液,浓缩至1ml。在300-600nm的范围内进行扫描。所得结果如下图所示。


 

图1黄色组分在不同波长下的吸光值   图2橙色组分在不同波长下的吸光



图3红色组分在不同波长下的吸光值


2.2.2分离液的抑菌性

将浓缩的三种色素按照管碟法的步骤进行抑菌实验。结果表明;桔黄色素具有较强的抑菌活性,对蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌显示很强的抑菌能力,对酿酒酵母和青霉菌生长不抑制。而黄色素与红色素对以上供试菌基本无抑菌活性。

将获得的橙色组分浓缩,再梯度稀释后进行抑菌实验,了解浓度与抑菌性的关系,结果如下图所示:


 

图4桔黄色素的吸光度与其抑菌性的关系


可见,橙色组分的抑菌性随其吸光度的增加,而不断增强。说明橙色组分的浓度越大,其抑菌活性越强,橙色组分的抑菌性与其浓度呈正相关的趋势变化。


2.3 Monacolin K的抑菌性

Monacolin K是红曲中的一个倍受瞩目的组分,关于它是否具有抑菌性,尚未见报道。所以本实验利用Monacolin K标准品进行了抑菌实验,所得的实验结果证实,Monacolin K对供试的各种菌均无抑菌作用。


3结论

从以上结果可以得出的结论是:红曲中还存在着除橘霉素以外的其它抑菌活性成分。



参考文献

[1]Wang HC, Pigmentation and antibacterial activity of fast neutron and X-ray-induced strains of Monascus purpureus Went, Plant Physion,1977,60:578-581

[2]董明盛等,红曲霉抑菌作用的探讨,中国调味品 1991,1:11-13

[3]童群义等,红曲色素抑菌作用的研究,食品工业科技 1997,5:25-27

[4]P.J.Blank, Characterization of Monascidin A from Monascus as Citrinin, International Journal of Food Microbioligy  1995,27:201-213

[5]徐尔尼等,红曲霉发酵液抑菌作用的探讨,中国畜产与食品 1998,1:11-12


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