一株红曲霉在限定环境生长的最适条件

一株红曲霉在限定环境生长的最适条件

成剑峰

（山西省食品工业研究所 太原 030024）

摘  要:本文对一株红曲霉(Monascus sp.)在25℃、30℃、35℃的生长进行了正交实验，确定了各因素的最佳组合，并对菌体孢子的萌发情况进行了观察。

关键词: 红曲霉  生长  条件

The Study on the Culture Condition of a Monascus sp. Strain

Grew at Special Environment

Cheng Jian Feng

(Shanxi Provincial Food Industrial Research Institute,Taiyuan 030024)

Abstract：An orthogonal design test,which determined the best combination of factors,has been performed. Monascus sp. culture was designed at 25℃,30℃,35℃,and the conidium was observed.

Key words：Monascus spp.   culture   condition

红曲霉在中国的应用有悠久的历史，它不仅是我国劳动人民最早发现的微生物，而且也是由我国劳动人民最早应用于食品加工中的有益真菌。有关红曲的生产方法和功用，明朝宋应星撰写的《天工开物》和李时珍撰写的《本朝纲目》中有较详尽的记载。红曲霉在我国古代被用于黄酒酿造、腐乳发酵、食醋酿造、食品着色及防腐等方面。受文化传统及饮食习惯的影响，红曲霉在国外主要用在肉类和其它食品的着色方面。红曲色素的主要成分是红色素、黄色素、和紫色素，这三种色素中又包含有2-3种组分，如红色素由红曲红素和红斑素组成，黄色素由红曲黄素和红曲黄色素组成，紫色素由红斑素胺和红曲红胺组成。红曲色素使用的广泛性和安全性使各国学者对红曲霉的研究更加深入，有关红曲色素方面的专利文献不断涌现。1979年，日本学者远藤章教授从红曲霉代谢产物中分离出胆固醇合成抑制剂后，红曲霉的研究热潮进一步升温，因为在某种意义上，Lovastatin的发现不亚于Penicillin的发现，由此，红曲霉的研究方向逐渐由红曲色素拓展到降血压、抑制胆固醇合成的生理活性物质的研究。我国对红曲霉的应用虽然最早，但相对于国外，在红曲霉的生理活性物质及作用机理方面的基础研究工作开展较晚。为使古老的红曲在今天能为人类更充分的服务，加强红曲霉的基础研究、功能开发及应用工作显得非常迫切。

红曲霉属于腐生真菌，它是从无生命的有机质中吸收营养成分，分布较广泛，在谷类、淀粉、枯枝、泥土、橡胶、鱼干、落叶等物质上都曾有发现红曲霉的报道。腐生菌之所以能分解自然界的大量有机物质，在物质循环中占有重要地位是他们本身含有丰富酶系的原因。红曲霉中含有淀粉酶、麦芽糖酶、糊精酶、蛋白酶，并且能自己合成生长素而不需要外源供给。同其他微生物一样，红曲霉的生长亦需要碳源、氮源、微量元素等基质，其中碳氮比对他的生长影响最大，因为一般微生物细胞的碳氮比是8-12:1，在微生物生长过程中，理论上50%的碳源供给呼吸的能量，50%的碳源组成微生物细胞，这样理想的生长培养基碳氮比是16-24：1，使足够的碳源供给微生物以全部利用氮源。除此以外，湿度、温度、PH等环境因子对其生长也有显著影响，均有最高限和最低限，超过最高限、低于低限均不能生长，即以最低生长温度开始，随着温度升高，红曲霉的生长速度随之加快，达到最适生长温度时，生长速度最快，温度如再上升，生长速度开始减慢，达到生长最高温度时，生长速度显著下降。

出于对红曲霉某些特定方面的研究目的，需要将它的生长控制在一定的温度范围内，在培养过程中，由于红曲霉有前期生长缓慢的生理特性，因此对环境条件作极为严格的要求，否则极易感染杂菌，尤其是青霉菌、黑曲霉菌、黄（米）曲霉菌群的感染几率最大，造成的损失最严重，由此原因带来的再次灭菌操作过程的工作量也最繁重。因此，研究红曲霉的最适生长条件显得非常必要。本实验用液态培养基静置培养的方法对红曲霉在一定温度范围的最适生长条件进行了正交试验。

实验中对红曲霉生长量的测定方法采用湿重法。红曲霉在适宜生长的环境条件下，吸收营养物质，通过异化和同化等代谢过程，将营养物质变成本身的细胞物质，因而增加了个体的体积，这是一切生理活动的综合反应。红曲霉的菌体是丝状的，它的生长测定不同于细菌等单细胞生物，丝状菌的生长主要是指菌体的生长量。本实验是在液体培养菌体的生长期完成后，通过离心、洗涤、再离心、称重等步骤，获得菌体重量。这种测定方法比较直接，适用于菌体浓度较高的样品，并且要求样品中不含有菌体以外的其他干物质。

1材料与方法

1材料

麦芽（市售）

琼脂（市售）

棉花（市售）

红曲霉实验菌株（本所菌种站保藏）

2设备

天平 试管  三角瓶 移液管 吸耳球 手提式高压杀菌锅 显微镜

3方法

3.1试管菌种的活化培养

菌株在液蜡、低温、缺氧环境中保存时间较长，生理活性被抑制，新陈代谢、生长繁殖几乎停止，因此，在正式开始实验前，须对供试菌株进行多次活化，使其从被抑制的状态中恢复过来。

3.1.1斜面培养基制备

培养基成分如下：

葡萄糖20g，N_aNO₃ 2g，KH₂PO₄1g，M_gSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.5g，F_eSO₄·7H₂O 0.01g，Z_nSO₄·7H₂O 0.01g，C_USO₄·5H₂O 0.005g，蒸馏水1000mL，琼脂              20g。

上述成分溶解在蒸馏水中，加热，等琼脂溶化后，灌装试管。每支试管中的装入量约为7mL左右。分装完毕，塞好棉塞，放入手提式高压灭菌锅内，0.1Mpa压力下灭菌30min。灭菌后的试管摆成斜面，备用。

3.1.2 菌种活化

在无菌条件下，用接种环挑取一环菌体，移入已灭菌的试管中（即上述备用试管），划曲线，在35℃条件下，直立试管培养7~9d，等菌落长成后，于以上操作相同条件下再次移接。斜置培养。菌种一般需经过3~5次转管活化后方能用于实验。

3.2实验用培养基的制作

实验用培养基选用麦芽汁液体培养基，其制作方法为：将发芽后经过干燥的大麦粉碎，粒度约40 ~60目加入四倍的水中，于60℃左右保温糖化4h，碘试不呈蓝色时，煮沸15min，滤布过滤出清夜，调整总固形物（折光计）达12°BX，分装三角瓶后于121℃条件下杀菌30min，备用。

3.3接种与培养

将无菌水加入斜面试管中，洗脱孢子，用灭菌移管液吸取孢子悬浮液，以3%的接种量移入灭菌后的液体培养基中，摇匀，置于25℃、30℃、35℃的条件下培养10d。

4实验设计及结果分析

正交试验是多因素分析的有力工具，能从许多因素中，选出主要因素及其最优水平。根据经验，本实验选定了培养基酒精含量、培养基酸度及培养温度3因素，分别设定3水平，且不考虑因素间的交互作用，实验见表1、表2：

表1 实验因素及水平

表2  L₉（3³）正交实验结果

从表2数据可推断：3个因素中，以酒精度的影响最大，酸度次之，当酸度达0.8%、酒精度达到6%（v/v）时，菌体未见生长；温度影响最小。由此可知：在本特定条件下，最佳的培养条件是：酒精体积分数2%，酸度0.5%，温度25℃。

5结果与讨论

5.1本实验中菌体的测定方法为湿重法，培养过程不应过长，否则因生长速率的关系在操作过程中易产生误差，本实验中的培养周期为10d。

5.2红曲霉前期生长十分缓慢，由此极易带来杂菌污染，通过显微镜观察，红曲霉的分生孢子较子囊孢子易萌发生长（见图1），一个世代后仍有未萌发的子囊孢子（见图2）。

图1  “      ”所示为萌发的分生孢子和菌丝体，“      ” 所示

为未萌发的散落的子囊孢子（20×10）。

图2“     ” 所示为未萌发的散落的子囊孢子（20×10）。

5.3红曲霉对乙酸、酒精的消耗如表3所示，表明红曲霉耐酸耐酒精。从对乙酸和酒精的消耗情况来看，酒精较乙酸好利用，这两种物质在高浓度时抑制其它菌的污染与繁殖的同时，也延缓了红曲霉自身的生长发育。

表3 红曲霉对乙醇、乙酸的利用

5.4笔者以为探讨红曲霉孢子萌发的最适条件，是解决红曲霉前期生长缓慢的重要途径之一。

5.5红曲霉所具有的降血压、降血脂的功效已被医药研究所证实。古老的发酵产品可加工成现代的食品、保健品的多种产品形式，造福人类。然而，自发现红曲霉代谢产物中可能含有一定量的桔霉素后，红曲霉产品的市场化进程受到挑战，红曲霉研究又有了新的热点。相信随着生物技术的进步和研究的不断深入，红曲产业的前景未可限量。

参考文献

[1]中科院微生物研究所．常见与常用真菌，北京：科学出版社，1973；

[2]傅金泉．中国红曲及其实用技术，北京：中国轻工出版社，1977；

[3]路秀玲等．红曲霉的应用研究现状及展望，食品科技，2001.1:85-87。