乙酸钠和甲硫氨酸对红曲霉发酵生成Monacolin K的作用

贾  波¹  周立平²

（1浙江大学材化学院生物工程研究所，杭州，310027）

（2 浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州，310032）

摘要：本文就乙酸钠和甲硫氨酸对红曲霉液体发酵生成Monacolin K的作用进行了研究，结果表明乙酸钠对Monacolin K的合成有促进作用，以少量多次添加的效果为佳，第5、6、7d分别添加0.1%乙酸钠时Monacolin K产量为158.985μg/mL，是对照的2.86倍。甲硫氨酸在浓度小于0.1％时才有略微的促进作用，在初始培养基中添加0.01%时Monacolin K产量提高约12.21%。当两者按照一定浓度比例添加时以在发酵中期加入为宜。

关键词：红曲霉  乙酸钠   甲硫氨酸  Monacolin K

The Effect of Sodium acetate and Met amino acidon Monacolin K production by Monascus spp.

Jiabo¹  Zhou Liping² 

（1 Research Institute of Bio-Chemical Engineering  Zhejiang University  Hangzhou  310027）

( 2 College of Biological and Environmental Engineering   Zhejiang University of Technology   Hangzhou  310014 )

Abstract：Effects of the possible precursors Sodium acetate and Met amino acid on yields of Monacolin K were studied. Sodium acetate could increase Monacolin K production. Adding of Sodium acetate with small scale more than once was better than large scale at one time. Yields of Monacolin K reached 158.985μg/mL when 0.1% Sodium acetate was respectively added into the medium during 5,6,7days, which was 1.86 times more than control. Only when Met amino acid was less than 0.1%, the slim promotion could be observed. 12.21% increase of Monacolin K was obtained when 0.01% Met was added into the origin medium. The optimal time to add Sodium acetate and Met by certain concentration was during the medium of whole fermentation.

Key Words：Monascus ;  Sodium acetate ;  Met amino acid ;  Monacolin K

1前言

功能性红曲由于含有能显著降低胆固醇、降低血脂功效的Monacolin K，引起了人们的极大关注。Monacolin K又叫洛伐他汀（Lovastatin）、mevinolin、mevacor等。据报道^[1]，能产生Monacolin K的菌种有曲霉菌（Aspergillus）、红曲霉菌（Monascus）、诺卡菌（Nocardia）、拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis）、毛霉菌（Mucor）和青霉菌（Penicillium）。而工业化生产Monacolin K的菌种主要是土曲霉和红曲霉，我国和日本多采用红曲霉，欧美等国多采用土曲霉。采用标记前体物对Monacolin K生物合成机理进行的研究已经证实^[2，3]，Monacolin K分子结构中的18碳和4碳两个聚酮体链都是由乙酸盐首尾相连而成，18碳链组成环状部分，4碳链则构成分子中的侧链，聚酮体链上的2个甲基来自于甲硫氨酸。作为前体物质，乙酸等短链脂肪酸能促进大环内酯类抗生素如螺旋霉素、利福霉素等的合成，其作用除作为前体物质外，还是乙酰辅酶A、丙酰辅酶A合成酶的诱导物^[4]。Monacolin K与大环内酯类抗生素的合成机理相似，都属于聚酮体（Polyketide）途径，因此推测乙酸盐、甲硫氨酸等可能对Monacolin K的合成有促进作用。有鉴于此，我们就乙酸钠和甲硫氨酸对红曲霉液体发酵生成Monacolin K的作用进行了初步研究。

2材料与方法

2.1 菌种

GM088（浙江工业大学红曲研究课题组保存）

2.2 培养基组成及培养方法

2.2.1 培养基组成

斜面培养基：12°Bx 麦芽汁琼脂培养基，pH 5.0左右

种子培养基：米粉3％，葡萄糖2％，黄豆饼粉1％，NaNO₃ 0.2%, MgSO₄·7H₂O 0.1%, KH₂PO₄ 0.15%, pH自然

发酵培养基：甘油5%，葡萄糖1%，可溶性淀粉1%，NaNO₃ 0.5%, MgSO₄·7H₂O 0.1%, KH₂PO₄ 0.15%, pH6.0-6.5

2.2.2 培养方法

斜面培养：30-32℃恒温培养4-5d。

种子培养：已培养好的新鲜斜面菌种，用10mL无菌水洗下斜面孢子，并刮下表面菌丝，接种于装有100mL种子培养基的500mL三角烧瓶中，在30℃、200rpm的旋转式摇床上培养22-24h。

摇瓶发酵培养：将培养好的种子液按10%的接种量接种于装有100mL发酵培养基的500mL三角烧瓶中，200rpm的旋转式摇床上30℃ 3d后转为26℃培养至12d结束。

2.3 分析方法

菌体鲜重的测定：发酵液5000 rpm离心15 min后，蒸馏水洗涤，电子天平称重即为菌体鲜重（g）。

   pH值的测定：DELTA320A/C酸度计（含数字式）测定。

Monacolin K的测定：发酵液用甲醇萃取（200rpm，30℃摇床振荡2.5-3h），8000r/min离心20min，上清液用有机滤膜过滤后按如下HPLC色谱条件进行分析：Shim-pack VP-ODS C₁₈ （4.6×150 mm;5μm）色谱柱，甲醇：18mM的磷酸溶液（77：23（v/v））为流动相，流速0.6mL/min，检测波长 237nm，柱温 30℃，进样体积20μL。

3结果与讨论

3.1 添加乙酸钠对红曲霉Monacolin K生成的作用

将不同浓度的乙酸钠加入发酵培养基中，实验结果见图1。实验表明，在初始培养基中加入一定浓度的乙酸钠，对Monacolin K的生成具有一定的促进作用。添加0.3%乙酸钠可提高产量约12.32%；当浓度大于0.3％时，菌体鲜重和产量开始下降；当乙酸钠的浓度为1.0%时，产量只有对照的47.32%。推测可能乙酸钠对菌体的作用类似于微量元素，高浓度作用下对菌丝体具有一定的毒害作用，抑制菌丝体的生长，使糖氮代谢异常。而且乙酸钠是生理碱性盐，被菌体利用后产生NaOH，使发酵液的pH值升高，这也可能是抑制产物合成的因素之一。同时乙酸钠也是一种碳源，所以在初始培养基中加入的乙酸钠很可能更多地被作为碳源用于菌丝体的生长而不能用于Monacolin K的合成，在发酵中后期加入乙酸钠可能更有利于Monacolin K的生产。以不添加乙酸钠作为对照，在发酵不同时间一次加入0.3%乙酸钠的实验结果见图2。

Figure 1   Yields of Monacolin K with various concentration of Sodium acetate

Figure 2  Yields of Monaconlin K with 0.3% Sodium acetate added once during various time( control---without Sodium acetate added )

实验表明，在第5、7d一次性添加0.3%乙酸钠对Monacolin K的合成具有显著的促进作用，产量均超过了100μg/mL，比不添加乙酸钠的对照产量分别要高134.47%、163.90%。可能这时加入的乙酸钠能够优先进入聚酮体的合成代谢途径，而无需消耗菌体自身代谢产生的乙酸盐，从而提高了Monacolin K的产量。在第10d一次性添加0.3%乙酸钠对Monacolin K的合成具有抑制作用，这可能是由于在发酵后期一次加入的乙酸钠太多，浓度变化太明显，菌株不能适应乙酸钠浓度的剧烈改变而使Monacolin K的合成受到抑制。

前体的使用方式不同，也会收到不同的效果，在青霉素的生产中曾采用少量多次的前体流加工艺，即减少了前体的毒性又提高了前体的利用率。在发酵不同时间分次添加乙酸钠的实验（表1）表明，分次添加的效果明显比一次性添加要好, Monacolin K的产量都在100μg/mL以上。其中以第5、6、7d分别添加0.1%乙酸钠的产量最高，是对照不添加乙酸钠产量的2.86倍，是第5d、7d一次性添加0.3%乙酸钠产量的1.32、1.18倍。

Table.1 Yields of Monacolin K with Sodium acetate added many times

during various time

表1 发酵不同时间分次添加乙酸钠对Monacolin K合成的影响

3.2 添加甲硫氨酸对红曲霉Monacolin K生成的作用

将甲硫氨酸以一定的浓度在不同时间加入发酵培养基中，实验结果见图3和图4。甲硫氨酸的添加有利于菌丝体的生长，浓度小于0.1%时对Monacolin K的生成略有促进作用。当添加0.01%甲硫氨酸时Monacolin K产量提高约12.21% ；当甲硫氨酸浓度超过0.1%时，产量明显下降。由图4可见，在初始培养基和第2d加入0.01％甲硫氨酸比在发酵中后期加入要好，这与乙酸钠的情况正好相反。可能在发酵中后期加入时，甲硫氨酸不能作为甲基的供体而被直接用作氮源促进了菌丝体的生长，外观表现为发酵液比较粘稠。

Figure 3  Yields of Monacolin K with various Met concentration added

Figure 4  Yields of Monacolin K with 0.01% Met added during various time

( control--- without Met added )

3.3 同时添加乙酸钠和甲硫氨酸对红曲霉Monacolin K生成的作用

将乙酸钠与甲硫氨酸配置成不同比例后在不同时间加入培养基中，结果见表2。0.4％乙酸钠与0.01％甲硫氨酸混合添加时效果最佳，其中又以第5d添加时Monacolin K的产量最高，达到了123.019μg/mL；0.3％乙酸钠与0.01％甲硫氨酸混合添加时效果其次，也以第5d添加时的产量相对最高，为121.046μg/mL。3.1和3.2的实验表明，乙酸钠在发酵中期加入为好，而甲硫氨酸在发酵前期加入为好。当乙酸钠与甲硫氨酸同时添加时，我们发现两者以同样的浓度比例添加时在发酵前期（2d）添加的效果不及发酵中期（5d）好，这可能是由于乙酸钠对Monacolin K的促进作用比甲硫氨酸更显著（3.1和3.2实验结果证明了这一点），因此当两者按照一定浓度比例添加时仍以在发酵中期为宜。

Table 2  Yields of Monacolin K with various ratio of Sodium acetate to

Met and various time added

表2  乙酸钠、甲硫氨酸不同浓度和时间添加对Monacolin K合成的影响

4结论

乙酸钠对Monacolin K的合成有促进作用，以少量多次添加的效果为佳。在本实验条件下，第5、6、7d分别添加0.1%乙酸钠的Monacolin K产量为158.985（μg/mL），是对照的2.86倍。甲硫氨酸仅在浓度小于0.1％时对Monacolin K的合成才有稍有促进作用，在初始培养基中添加0.01%甲硫氨酸时Monacolin K产量提高约12.21%。当两者按一定浓度比例添加时以在发酵中期加入为宜。

参考文献

[1]熊晓辉，张李阳，韦策等.一株Monacolin K高产菌株生理特性，生物技术,2003,13（6）:24-26.

[2]Chan J.K., Moore R.N., Nakashima T, et al. Biosynthesis of mevinolin spectral assignment by double-quantum coherence NMR after high carbon-13 incorporation. J. Am.Chem.Sco. 1983,105:3334-3336.

[3]R N Moore, G Bigam, J K Chan et al. Biosynthesis of the hypocholesterolemic agent mevinolin by Aspergillus terreus. Determination of the orign of carbon, hydrogen, and oxygen atopms by 13C NMR and mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 1985, 107(12): 3694-3701。

[4]陈代杰,朱宝泉.工业微生物菌种选育与发酵控制技术，上海科学技术文献出版社,1995年2月.