高 monacolin K 生成量红曲变异株之研究

高 monacolin K 生成量红曲变异株之研究

潘子明¹  李俊霖¹  王志傑²

¹国立台湾大学微生物与生化学研究所 

²大仁技术学院生物科技系

摘要：红曲 (Monascus) 之应用在我国已有千年的历史，其二级代谢物 monacolin K 和 γ-胺基丁酸 (γ-amino butyric acid，GABA) 经证实具有降胆固醇和降血压之功效。本研究由红曲米中筛选得含高 monacolin K 生成量之红曲菌株 Monascus purpureus HM105，以在来米进行固态培养 monacolin K 产量可达 7700 mg/kg，为一般红曲米的 10-15倍，但亦含有 2500 ppb 的 citrinin。橘霉素 (citrinin) 为肝肾毒素，对人体有害。本研究以传统变异方法处理红曲菌株，筛选得降低 citrinin 至 939 ppb 且提高 monacolin K 产量至 9500 mg/kg 之变异株 M. purpureus NTU568。并探讨在山药基质与液态培养中次级代谢物之生成量。除了针对变异株中 monacolin K 之生成量进行探讨，亦分析 GABA 与抗氧化物质等保健成份。结果显示M. purpureus NTU568 以山药进行固态培养时，monacolin K生成量将高达 15540 mg/kg。以 5 % 的山药粉为基质进行酦酵槽液态培养，干菌体中monacolin K 生成量高达 20513 mg/kg。M. purpureus NTU568 抑制共轭双烯形成与还原能力之抗氧化效果与 50 mM 之 vitamin C 相近。

关键词：红曲，变异，monacolin K，γ-胺基丁酸

Study on high monacolin K productivity by Monascus mutant

Tzu-Ming Pan¹, Chung-Lin Lee¹, Jyh-Jye Wang²

¹ Institute of Microbiology and Biochemistry, National Taiwan University,

Taipei, Taiwan

²Department of Biotechnology, Tajen Institute of Technology, Pingdon, Taiwan

Abstract：Monascus species is a Chinese traditional fermentation fungus used on food for over thousands of years in China. Secondary metabolite products of Monascus, monacolin K and γ-amino butyric acid (GABA) are antihypercholesterolemic agent and hypotensive agent. In this study, Monascus purpureus HM105 that was collected from red mold rice would produce high concentration of monacolin K of 7700 mg·kg^-1, but also produced citrinin of 2500 ppb. Since citrinin was a mycotoxin and possessed nephrotoxic and hepatoxic effect, it had negative impact on the acceptance of red mold rice by people. Hence, this study used mutagenesis (NTG, EMS and UV light) to treat M. purpureus HM105, and screened out the optimum strain, M. purpureus NTU568 that produced fewer citrinin of 939 ppb and more monacolin K of 9500 mg·kg^-1. The production of secondary metabolites and antioxidant activity of M. purpureus NTU568 would be investigated further by different solid cultivation media (dioscorea) and submerged culture (Hinton flask and jar fermentor). The results proven that when M. purpureus NTU568 was fermented by solid cultivation in dioscorea media, the monacolin K production would increase to 15540 mg·kg^-1. However, the pellets of M. purpureus NTU568 could also produce high monacolin K concentration of 20513 mg·kg^-1 by submerged cultivation of jar fermentor in 5% dioscorea media. The results of antioxidant activity indicated that conjugate dienes inhibition and reducing power of red mold rice produced by M. purpureus NTU568 were as strong as 50 mM vitamin C.

Key Words: red mold rice, mutation, monacolin K, γ-aminobutyric acid (GABA)

前  言

红曲菌是中国已使用数千年之食品酦酵菌种，中国古籍中早有记载其特殊功效及在食品上的应用。而红曲菌的代谢产物—monacolin K、GABA 经证实具有降低胆固醇及降低血压的功效⁽¹⁾，另外Aniya 等人提出红曲酦酵萃取物中含有具抗氧化效果的 dimerumic acid⁽²⁾。由于红曲米中含有多种保健功效的成分，随着机能性食品之发展而日渐被重视。近年来脑心血管疾病已是全世界许多国家所面临到的严重问题，故在预防与治疗上皆是目前众多研究的重点。红曲中的 monacolin K 为 HMG-CoA reductase 的抑制剂，进而可抑制胆固醇的生合成⁽³⁾。Monacolin K 与 lovastatin 为相同之结构物质。但 lovastatin 目前主要应用于药物上，工业上多由 Aspergillus terrus 生产。近年来许多红曲保健食品中的monacolin K均被指出是 Aspergillus terrus 酦酵后而外加入的，由于 Aspergillus terrus 并非食品用菌种，因此在食用上有安全之疑虑。由于红曲次级代谢物中具有降胆固醇成分 monacolin K 与降血压物质 GABA 等有效的保健成份而逐渐受到重视。但许多市售红曲米与多数的菌种所含有的 monacolin K 均较低，含量多在0.5 mg/g 以下⁽⁴⁾，而 monacolin K 对人体之建议食用量至少为 5-10 mg/day。因此低 monacolin K 生成量之红曲菌株在发展与应用上皆受到限制。故开发高 monacolin K 产量的红曲菌株为目前重要的研究课题。

就红曲未来之开发与应用言，具有高浓度保健成份将大幅提高红曲产品的经济价值。本研究室于红曲米中筛选到具高 monacolin K 生成能力之红曲菌株 M. purpureus HM105，其 monacolin K 产量可达 7700 mg/kg。国内外研究报告中均未发现具有如此高 monacolin K 产量的红曲菌株 (表一)^(5-12)。但此红曲菌株亦生成 2500 ppb 的 citrinin，相对的将降低其被接受度与安全性。Citrinin 是一种典型的霉菌毒素，最早是由 Penicillium citrinum 中发现，之后于 Aspergillium spp. 及 Monascus spp. 中陆续发现^(13,14)。Citrinin 对肝肾均有毒害作用，无论固态培养或液态培养物中均含之，其含量约为 100-400 mg/L。Monica 等人亦由 12 种红曲米中发现均含有 0.2-12 ppm 的citrinin⁽¹⁵⁾ 。另外于台湾的研究中指出市场的红曲产品中可侦测出 0.1-122 ppm的citrinin ⁽⁴⁾。因此，降低 citrinin 之生成量为目前开发红曲保健食品上最重要的研究课题。

红曲具有抗氧化之功效最早是于 1999 年 Aniya 等人所提出⁽²⁾，并指出主要抗氧化的物质为 dimerumic acid，其为天然的 siderophore，与 Fe3+ 有高度亲和力，具有抗氧化的功效。在低浓度时具有较佳的清除 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 自由基之能力，并减低活性氧 (active oxygen species)，如超氧阴离子 (superoxide anion, ∙O2–) 及氢氧自由基 (hydroxyl radical, ∙OH)⁽¹⁶⁾。因此抗氧化的功效已成为红曲研究的重要课题之一。

早期的研究中，红曲次级代谢产物之研究以色素方面最为深入，许多研究学者为增加红曲色素之生成量，经常利用物理或化学之变异方法行菌种改良^(17-20)。色素与 citrinin 均属 polyketide 结构之化合物，1995 年远藤教授利用物理变异法：紫外线照射法及化学变异法： N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) 诱变法来进行诱导变异以筛选出低 citrinin 或不产生 citrinin 之菌株⁽²¹⁾。由于 M. purpureus HM105可生成高量的 monacolin K，产量可达 7700 mg/kg，但亦含有 2500 ppb 的 citrinin。故本研究以传统变异方法处理红曲菌株，针对红曲中 citrinin、monacolin K 与 GABA 的生成进行探讨，期望得到高产量 monacolin K 与 GABA，低 citrinin 生成量之变异株。此外，本研究亦进一步探讨所得最佳红曲变异株之抗氧化能力，并利用山药做为酦酵基质以期望红曲山药可得到较佳的抗氧化效果。

1材料与方法

1.1菌株与种菌之培养

本研究使用之菌株有M. purpureus HM105, M. purpureus BCRC 31615, M. sp M-13, M. sp KT 及 Bacillus subtilis。其中M. purpureus HM105筛选自市售红曲米，被作为本研究之变异母株。菌株之培养基为Potato Dextrose Agar (PDA)。将红曲菌株分别培养于PDA 培养基五天后，挖取菌块接种至种菌培养基 (其组成为：glucose 100 g、peptone 10 g、KNO₃ 2 g、NH₄H₂PO₄ 2 g、MgSO₄‧7 H₂O 0.5 g、CaCl₂ 0.1 g、蒸馏水1000 mL，pH 6.0)，30℃、110 rpm振荡培养约48 hr后备用。

1.2红曲米之酦酵制备

将市售在来白米或山药 500 g，以水洗涤至不呈混浊，浸水8小时。用棉布滤水，置于曲盘上，于高压杀菌釜内蒸饭15分钟，取出冷却后洒水搅拌均匀再蒸饭15分钟，取出冷却至40℃，完成蒸米之程序。取红曲种菌液 (5%)，接种入蒸饭中，并充分搅拌均匀后，开始培养于木制之曲盘 (30 × 20 × 5 cm)。其间经翻拌、头水、次水、完水及后熟等步骤完成培养，培养条件为30℃，10天。之后将培养所得之曲米进行各项分析⁽¹⁾。

1.3变异处理

选取M. purpureus HM105作为本研究之变异母株 (parental strain)，30℃下培养于PDA上3天后进行变异处理，方法叙述如下：

1.3.1 UV照射变异：取4 mL的菌液 (10⁶ spores/mL) 均匀分布于Petri dish 上，并利用15 W的紫外灯以 30 cm 距离照射不同时间并求得90% 致死率之最佳时间，照射后于暗室内静置 30 min。收取菌液、离心并用无菌水洗涤三次后培养于PDB培养基内 30℃、6-8小时，然后将含红曲菌之培养液均匀涂布于PDA平面培养基上培养72小时，待单一菌落形成后转殖斜面培养保存以进行各代谢产物之产量分析。

1.3.2 NTG或EMS之化学变异处理：取1 mL之EMS (30 μl/mL, 0.2 M pH 5.0 citrate buffer)或 NTG (100 μg/ml, 0.2 M pH 5.0 citrate buffer)溶液，加入1 mL的悬浮菌液 (10⁶ spores/ml) 并培养于30℃及不同的反应时间下以求取90%致死率之最佳时间。待作用后加入1000 mL的无菌水以终止反应。之后经过离心、三次水洗后培养于PDB培养基上30℃、6-8小时，然后将含红曲菌液之培养均匀涂布于PDA平面培养基上培养72小时，待单一菌落形成后转殖斜面培养保存以进行citrinin产量分析。

1.4利用生物分析法以筛选低 citrinin生成菌株

将Bacillus subtilis于PDB 培养基中培养30℃、24 hr后，将 200 μL Bacillus subtilis菌液均匀涂布于PDA平面培养基上。取变异株转殖于上述之 PDA 培养基上培养三天，并观察是否产生抑制环。选取具产生较小或不产生抑制环的红曲菌株作为筛选菌株（选取抑制率大于 99% 之变异株），并分析抑制环上的citrinin含量，以建立inhibition zone大小与citrinin含量之关系。最后确认最适菌株以探讨citrinin、monacilon K和GABA生成之关系⁽²²⁾。

抑制率(%) = [(C – E)/C] ×100

C 为母菌株抑制环之大小；E 为变异株抑制环之大小。

1.5分析方法

1.5.1Citrinin 之萃取方法

称取样品 1 g，加入 10 mL 之 methanol 于 50℃ 下萃取 1.5 小时，过滤后再以 10 mL isooctane 萃取去除分析液中之油脂。加入等体积之水并以硫酸酸化至 pH 为4.5，再以 10 mL chloroform 萃取并取下层萃取液蒸干再加入 1 mL methanol 溶解之，以 0.45 µm 滤膜过滤后进行 HPLC 分析⁽¹⁴⁾。

Citrinin HPLC 分析条件：Citrinin 之分析是使用高效液相层析法 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)，层析管柱为 C18 column (LiChroCART^® 250-4, Merck)，移动相为 water：acetonitrile：triflouacetate (450：550：0.5)，流速: 1 mL/min，以荧光侦测器 (Rainin FL-1) 侦测，excitation λmax = 330 nm，emission λmax = 500 nm⁽²³⁾。

1.5.2 Monacolin K 之分析方法 

称取样品 1 g，加入 5 mL ethyl acetate，于 70℃ 水浴中加热 1.5 hr 进行萃取，取上清液，置于抽气柜中使其挥发至干，再以等量之 acetonitrile 溶解，以 0.45 µm 滤膜过滤后进行 HPLC 分析⁽⁷⁾。

HPLC分析条件：层析管柱为 Beckman Ultrasphere ODS (150×4.6 mm )，移动相为 acetonitrile：0.5% phosphoric acid (65：35)，流速: 0.7 mL/min，以 UV 侦测器侦测，λmax = 238 nm。

1.5.3 GABA 之分析方法

将 GABA 进行衍生化为 PTC-GABA 是根据以下Rossetti等人所提出之方法(24)。称取样品 1 g，加入 5 mL 70% ethanol，于 70℃ 水浴中加热 2 hr 进行萃取，取上清液 200 μL，置于抽气柜中使其挥发至干，再以 ethanol : water : triethyl amine (2:2:1) 回溶后进行干燥，再加入 ethanol : water : triethyl amine : PITC (phenylisothiocyanate) (7:1:1:1) 60 μL 回溶，反应 20 分钟以形成 PTC-GABA，溶剂进行真空干燥。并以GABA 标准品进行检量线之制作。所得之干燥物以 200 μL 移动相回溶，移动相之组成为 A：B = 80：20 (A 液为 1000 mL 之水中含有 8.205 g sodium acetate、0.5 mL triethyl amine、0.7 mL acetate、5 mL acetonitrile，pH 5.8；B 液为 acetonitrile：water = 60：40，pH 5.8)。

HPLC分析条件：层析管柱为C18 column (LiChroCART® 250-4, Merck)，流速 0.6 mL/min，以 UV 侦测器侦测，λmax = 254 nm。

1.5.4 色素分析

色素浓度分析采用分光光度计分析法并于500 nm 或 400 nm 波长下测其吸光值，做为红色与黄色色素之指标。称取1 g的红曲米以乙醇适当稀释后测定之。色素浓度以Aabs/g rice 表示之(18)。

1.6 红曲酦酵产物清除DPPH 自由基能力之测定

红曲清除自由基能力之测定是参考Aniya等人所述方法(2)。秤取1克的红曲米、酦酵山药或干菌体，加入4 mL 0.05M之Tris-HCl buffer (pH 7.4)，于37℃下加热60 分钟后离心15分钟 (5500 x g)。取澄清液储存于4℃下备用。取1 mL 0.1 mM DPPH (溶于酒精) 分别加入0.95 mL Tris-HCl buffer (0.05 M ，pH 7.4)、1 mL酒精及50 μL之曲米抽出液，分别反应30 分钟后于 517 nm 波长下测其吸光值。吸光值越低者表示样品的供氢能力越强，并计算样品的清除率 (scavenging effect %)。另以等体积去离子水做为控制组。

1.7 还原力的测定

还原力之测定是参考 Oyaizu 所述的方法(25)。取2.5 mL的样品萃取液 (0.25 g /mL) ，加入2.5 mL磷酸缓冲溶液 (0.2 M，pH 6.6) 及2.5 mL 1% K3Fe(CN)6 ，置于50℃水浴20分钟后快速冷却。再加入2.5 mL 10% 三氯醋酸溶液。以 5500 x g 离心10分钟后，取上层澄清液5 mL，加入5 mL的去离子水及l mL 0.1% FeCl3 ，混合均匀并反应10分钟后，使用分光光度计检测700 nm之吸光值。吸光值越高表示样品的还原力越强。

1.8共轭双烯之测定(26)

取2 mL linoleic acid emulsion (0.02 M，pH 6.6)，分别加入0.1 mL不同浓度的样品萃取液 (0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g 酦酵物/ml)。混合均匀后置入37℃暗室。于12、24及48小时分别取出0.2 mL，加入7 mL 80%的CH3OH，测234 nm之吸光值。另以等体积去离子水做为控制组。

Linoleic acid emulsion (pH 6.6)之配置：50 mL 之0.02 M phosphate buffer (pH 6.6) 加入0.284 g之linoleic acid及0.2804 g之Tween 20，以均质机均质成乳化液即可。此乳化液愈新鲜配置愈佳。

2结果与讨论

2.1红曲变异与最适菌株之筛选

M. purpureus HM105 是由红曲米中筛选得到的一株具有高 monacolin K 生产力的红曲菌株，本研究室在预实验中以在来米为基质进行固态培养，可生成高达 7700 mg/kg 的 monacolin K，其浓度为一般红曲菌种之酦酵产物的 15 倍以上。事实上 M. purpureus HM105 亦是一株可生成较高 polyketide 衍生物的红曲菌株，其酦酵产物除了具有较高含量的 monacolin K ，色素与citrinin 也会伴随着大量生成。尤其 citrinin 为具有肝肾毒性的霉菌毒素，在食用上有安全之虞。故本研究使用传统变异方法处理 M. purpureus HM105，以改变 citrinin 之生成基因，进而降低 citrinin 生成量。

本研究以 NTG，EMS 与紫外线照射等变异方法使 M. purpureus HM105 产生变异，低 citrinin 生成量之红曲变异株的筛选是采用本研究室先前的研究方法(22)：利用 citrinin 具有抑制 Bacillus subtilis 生长之特性进行筛选，此方法在先前的研究中证明其可有效筛得生成较低 citrinin量的红曲菌株。图一中抑制环的部分即为 citrinin 抑制 Bacillus subtilis 生长情形。当红曲菌株所生成的citrinin 含量越高，则所产生的抑制环区域则越大。本研究以此筛选方法，由 700 株变异株中得到8 株较低 citrinin 生成量的变异株 (示如表二)。

表二中的红曲菌变异株以米为酦酵基质经固态酦酵后所生成的次级代谢物除了citrinin生成量有明显下降外，其它次级代谢产物 (monacolin K、GABA及色素) 皆有不同程度的增减，其中仅有 M. purpureus NTU568 具有较佳的结果，其 monacolin K 可由 7700 mg/kg 显著提高至 9500 mg/kg，citrinin 则由 2500 ppb 大幅降低为 939 ppb，GABA 的生成量也由 1120 mg/kg 些微提高至 1533 mg/kg。由于本研究期望经由变异处理后，菌株中的 citrinin 生成量因此而下降，并同时使得monacolin K 与 GABA 的生成量有提高之效果。由于M. purpureus NTU568符合预期，因此本研究将以 Monascus purpureus NTU568 做为试验之红曲菌株，探讨培养方式 (Hinton摇瓶及酦酵槽) 与酦酵基质 (米及山药) 对次级代谢物生成量之影响。由于 citrinin、monacolin K 与色素物质皆属于 polyketide 的衍生物，故三者之代谢路径具有密切关系。Hajjaj等人曾提出 citrinin 与色素之间生成途径有其相关性(27)。红曲菌在 polyketide的代谢路径中，tetraketide 为 citriinin 与色素的共同前驱物，并以此为分支点，故 citrinin 经常与色素同时存在于红曲酦酵产物中(28)。传统变异法是以随机的方式改变红曲的基因，而抑制酵素蛋白质的生成，进而影响代谢生成途径。在变异过程中，当 citrinin 生成途径受到改变时，这也将造成 monacolin K 与色素物质的生成受到影响，因此当 citrinin 受到抑制时，则可能会提高色素的生成量。由表二之结果可得知当 citrinin 降低时，色素量确实有提高的现象。

2.2不同培养方式与培养基质之探讨

山药于近几年的研究中均指出其具有较佳的抗氧化效果(29-31)。而本研究室先前的研究亦发现利用山药作为酦酵基质可大幅提高 monacolin K 的生成，M. purpureus NTU601 以在来米与山药酦酵的 monacolin K 产量分别为 156 mg·kg-1 与 1833 mg·kg-1，产量可提高 10 倍以上 (数据未显示)。又因山药与红曲皆具有抗氧化的效果，故本研究以山药作为培养基质，以期望抗氧化能力能有加乘效果，并提高 monacolin K之生成能力。将最优良之红曲变异株 M. purpureus NTU568 以山药为基质进行固态培养，并于不同组成份之液态培养基中培养。但由表三结果显示，固态培养下红曲山药对于提高 monacolin K 的生成效果并不如 M. purpureus NTU601，M. purpureus NTU568 以在来米为基质进行固态培养后，monacolin K 生成量为 9500 mg·kg-1；但以山药为基质进行固态培养时 monacolin K 生成虽然可显著提高至15540 mg·kg-1，但其上升的幅度并不如 M. purpureus NTU601 一样具有 10 倍量之效果。红曲山药产生高 monacolin K的原因至今尚未明了，但于先前之研究中我们发现多数的红曲菌株利用山药基质进行固态培养时皆可较以在来米为基质酦酵时生成较高量的 monacolin K，提高的幅度因不同菌株而有差异。 

M. purpureus NTU568 液态培养之研究系以酦酵槽与 Hinton 瓶进行，以探讨对于次级代谢物的影响。液态培养基的组成分别单纯是以在来米粉 (5%) 或山药粉 (5%) 为基质，目的是为了与上述固态培养进行比较，以探讨培养方式对于次级代谢物之影响。其结果发现 M. purpureus NTU568 分别以酦酵槽与 Hinton 瓶进行液态酦酵后所得之次级代谢产物其生成量有显著差异。由表三得知利用酦酵槽进行液态培养，无论是于菌液或菌体中所得的次级代谢物皆较使用Hinton 瓶培养法来的高。由表三得知，以在来米为基质进行固态培养时 monacolin K 之生成量为 9500 mg/kg，以在来米为基质进行酦酵槽液态培养时 monacolin K 之生成量会些微提高至 10592 mg/kg。以 5% 山药粉末为主要基质之酦酵槽液态培养 M. purpureus NTU568 可生成高达20513 mg/kg的 monacolin K。由上述的结果中发现，以山药为基质并配合酦酵槽之液态培养，菌丝体中可生成高产量的 monacolin K，但 citrinin 的浓度亦随 monacolin K 之提高而增加。

本研究结果显示以酦酵槽进行培养时，菌体会生成较多 monacolin K，但以Hinton 瓶培养其生成量则显著较低，探究其原因可能是酦酵槽进行酦酵时会有较高且稳定的通气量，而以 Hinton 瓶培养时其通气量较低。Hajjaj等人指出于液态培养时提高通气量将使citrinin 与色素等 polyketide 衍生物之生成量提高(28)。此一论述与本研究之结果相符，亦即红曲菌之 polykedite 代谢途径之走向深受通气量之影响。故以具有较高且稳定通气量之酦酵槽培养，其菌体中 monacolin K 生成量将会显著高于 Hinton 瓶培养的产量。

2.3酦酵产物之抗氧化能力评估

红曲酦酵产物之保健功效于近年来陆续被开发研究(2, 16, 33)，保健成份除具降胆固醇功效之 monacolin K 与降血压效果之 GABA 外，红曲之抗氧化效果逐渐受到重视。山药为单子叶薯蓣科之植物，其富含淀粉，且于许多研究中皆被提出具有较佳抗氧化效果，故本研究利用山药做为红曲酦酵培养基质，期望抗氧化能力具有相乘效果。

红曲米及红曲山药之 DPPH自由基清除能力如表四所示。以在来米进行固态与酦酵槽培养时，其酦酵产物之 DPPH 自由基清除能力可达 50%，比母菌株 M. purpureus HM105 之酦酵产物为高；以山药为基质酦酵所得之酦酵产物，其 DPPH 自由基清除能力较在来米所得的酦酵产物佳，但不经酦酵之山药其自由基清除能力却较红曲山药高 5-10%。

抑制共轭双烯之形成能力效果如表四所示，M. purpureus HM105 与M. purpureus NTU568 以固态与液态酦酵槽酦酵所得的产物具有较佳的效果，抑制率皆可达 80-90%，其效果与 50 mM 的维生素C 无显著差异。其中 M. purpureus NTU568 以固态培养所得的红曲米与红曲山药对于共轭双烯的抑制于反应 12 hr 即可达70% 以上，反应持续至48 hr 时抑制率依然可维持于70% 以上 (图二)。红曲酦酵产物之还原能力试验如表四所示，M. purpureus NTU568 以固态酦酵所得之红曲米具有与 50 mM 的维生素C相同效果之还原能力，且固态培养下酦酵所得的红曲米其还原能力会较红曲山药佳，但是以酦酵槽培养时，红曲山药之还原能力则会显著高于红曲米。

由上述红曲变异株之酦酵抽出物对 DPPH 自由基清除效果、抑制共轭双键之形成与还原能力之结果可发现 M. purpureus NTU568 以在来米为基质进行固态酦酵后，红曲米具有较佳的还原能力与抑制共轭双烯形成之效果；固态培养下的红曲山药则对于DPPH 自由基清除效果、抑制共轭双键形成之效果与还原能力皆有较好的效果，其抗氧化的效果与 50 mM 之 维生素C 相近。此外，以液态酦酵槽培养时，M. purpureus NTU568 以在来米粉或山药粉之酦酵所得之干菌体具有较佳的抗氧化效果。

在本研究之抗氧化评估可得知 M. purpureus HM105 与M. purpureus NTU568 的酦酵产物均确实具有抗氧化的效果，其中对于共轭双烯形成的抑制与还原能力皆有较好的效果，且其功效与 50 mM 维生素C 并无显著差异。固态与液态酦酵之红曲山药与红曲米皆有不错的抗氧化功效，虽然红曲山药的抗氧化能力并无预期的相乘效果，但表四中以 M. purpureus NTU568 酦酵之红曲山药对于自由基清除能力皆较红曲米好。

2.4最适红曲变异株与其它红曲菌株及市售红曲米之次级代谢物生成量与抗氧化能力之比较

表五为M. purpureus NTU568 与其它红曲菌株及市售红曲米之次级代谢物生成量的比较，由表五可发现此变异株所酦酵生成之 monacolin K 显著高于市售红曲米与其它红曲菌株，而citrinin 生成量也较低，不仅含有降血压物质 GABA 与抗氧化成分，且其抗氧化效果也较市售红曲米佳。

3结 论

本研究以传统变异方法处理红曲菌株 M. purpureus HM105，筛选得变异株 M. purpureus NTU568，其citrinin 可由 2500 ppb 降低至 939 ppb， 且monacolin K 产量由 7700 mg·kg-1 提高至 9500 mg·kg-1。将M. purpureus NTU568 以山药进行固态培养可生成15540 mg·kg-1 之monacolin K。利用酦酵槽进行液态培养时，polyketide 之次级代谢物主要存在菌体的部分，值得注意的是以 5 % 的山药粉为基质进行酦酵槽培养时，将生成高达 20513 mg/kg 之monacolin K。最适红曲变异株—M. purpureus NTU568 于抗氧化之研究中，其对于抑制共轭双烯形成与还原能力有较佳的效果，且抗氧化的效果与 50 mM 之 vitamin C 相近。本研究筛选得到的红曲变异株—M. purpureus NTU568 应为近年来红曲研究中含有高 monacolin K 生成量且低 citirnin 生成量之红曲菌株，其 monacolin K 为一般红曲菌株与市售红曲米的 15-20倍。本研究期望此高 monacolin K 生成量之红曲菌株可促进未来保健食品的研究与发展。

参考文献

[1] Su, Y. C., J. J. Wang., T. T. Lin, and T. M. Pan. 2003. Production of the secondary metabolites γ-aminobutyric acid and monacolin K by Monascus. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30:40-46.

[2] Aniya, Y., T. Yokomakura, M. Yonamine, K. Shimada, T. Nagamine, M. Shimabukuro and H. Gibo. 1999. Screening of antioxidant action of various molds and protection of Monascus anka against experimentally induced liver injuries of rats. Gen. Pharmacol. 32:225-231.

[3] Albert, A. W., J. Chen, and J. Springer. 1980. Mevinolin: a highly potent competitive inhibitor of hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase and a cholesterol lowing agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3957–3961.

[4] Hsieh, Y. T., and T. M. Pan. 2002. The analytic methods and assays for secondary metabolites of Monascus products. J. Biomass Energy Soc. of China 21:63–71.

[5] Endo, A., K. Hasumi, and S. Negishi. 1985. Monacolins J and L, new inhibitors of cholesterol biosynthesis produced by Monascus ruber. J. Antibiot. 38: 420–422.

[6] Manzoni, M., S. Bergormi, M. Rollini, and V. Cavazzoni. 1999. Production of statins by filamentous fungi. Biotechnol. Lett. 21:253-257.

[7] Wang, U. L., J. Y. Houng, H. S. Chang, H. C. R. Chien, and W. H. Hsu. 1998. Selection of drug-resistant mutants Monascus pilosus for enhanced monacolin K production. J Chin Agric Chem Soc 36: 192–200.

[8] Lai, L. T., C.C Pan, and B. K. Tzeng. 2003. The influence of medium design on lovastatin production and pellet formation with a high-producing mutant of Aspergillus terreus in submerged cultures. Proc. Biochem. 38:1317–1326.

[9] Schneweis, I., K. Meyer, S. Hormansdorfer and J. Bauer. 2001. Metabolites of Monascus ruber in silages. J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 85:38–44.

[10] Chang, Y. N., Y. C. Lin, C. C. Lee, B. L. Liu, and Y. M. Tzeng. 2002. Effect of rice--glycerol complex medium on the production of Lovastatin by Monascus ruber. Folia Microbiol (Praha). 47:677–84.

[11] Casas López, J. L., J. A. Sánchez Pérez, J. M. Fernández Sevilla, F. G. Acién Fernández, E. Molina Grima, and Y. Chisti. 2003. Production of lovastatin by Aspergillus terreus: effects of the C:N ratio and the principal nutrients on growth and metabolite production. Enz. Microbial Technol. 33: 270–277.

[12] Wang, J. J., C. L. Lee, and T. M. Pan. 2003. Improvement of monacolin K, γ-aminobutyric acid and citrinin production ratio as a function of environmental conditions of Monascus purpu reus NTU 601. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 6696–6676.

[13] Deruiter, J., J. M. Jacyno, R. L. Davis, and H. G. Cutler. 1992. Studies on aldose reductase inhibitors from fungi. I. Citrinin and related benzopyran derivatives. J. Enzyme Inhibition 6:201–210.

[14]Blanc, P. J., J. P. Laussac, J. Le Bars, P. Le Bars, M. O. Loret, A. Pareilleux, D. Prome, J. C. Prome, A. L. Santerre, and G. Goma. 1995. Characterization of monascidin A from Monascus as citrinin. Int. J. Food Microbiol. 27:201–213.

[15] Monica, S., F. M. Roel, and F. G. Johanna. 1999. Mutagenicity of commercial Monascus fermentation products and the role of citrinin contamination. Mutation Research 444:7–16.

[16] Aniya, Y., I. I. Ohtani, T. Higa, C. Miyagi, H. Gibo, M. Shimabukuro, H. Nakanish, and J. Taira. 2000. Dimerumic acid as an antioxidant of the mold, Monascus anka. Free. Radi. Biol. Medic. 286:999–1004.

[17] Su, Y. C., and J. H. Huang. 1976. Studies on the production of anka-pigment. J. Chin. Agr. Chem. Soc. 14: 45–58.

[18] Lin, C. F., and H. Iizuka. 1982. Production of extracellular pigment by mutant of Monascus kaoliang sp. nov. Appl. Enviro. Microbiol. 43:671–676.

[19] Hiroi, T., T. Shima, T. Suzuki, M Tsukioka, and N. Ogasawara. 1979. Hyperpigment productive mutant of Monascus anka for solid culture. Agric. Biol. Chem. 43:1975–1976.

[20] Yongsmith, B., S. Krairak, and R. Bavavoda. 1994. Production of yellow pigments in submerged culture of a mutant of Monascus spp. J. Ferment. Bioeng. 78:223–228.

[21] Endo, A. 1979. Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent produced by Monascus species. J. Antibiot. 32:852-854.

[22] Wang, J. J, C. L. Lee, and T. M. Pan, 2004. Modified Mutant Method for Screening Low Citrinin-producing Strains of Monascus purpureus on Rice Culture. J Agri. Food Chem. (accepted)

[23] Kycko, S., S. S. Shiho, K. Yoko, and M. Tamio. 1998. Analytical method for citrinin in Monascus colour. Jpn. J. Food. Chem. 5:64-68.

[24] Rossetti, V., and A. Lombard. 1996. Determination of glutamate decarboxylase byhigh-performance liquid chromatography. J. Chromatography 681:63–67.

[25] Oyaizu, M. 1986. Antioxidative activity of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi. 35:771-775.

[26] Lingnert, H., K. Vallentin, and C. E. Eriksson. 1979. Measurement of antioxidative in model system. J. Food Proc. Pres. 3:87-103.

[27] Hajjaj, H., A. Klaebe, M. O. Loret, G. Goma, P. J. Blanc, and J. Franc ois. 1999. Biosynthetic pathway of citrinin in the filamentous fungus Monascus ruber as revealed by 13C nuclear magnetic resonance. Appl. Environ. Microbiol. 65:311–314.

[28] Hajjaj, H., P. Blanc, E. Groussac, J. L. Uribelarrea, G. Goma, and P. Loubiere. 2000. Kinetic analysis of red pigment and citrinin production by Monascus ruber as a function of organic acid accumulation. Enz. and Microbiol. Technol. 27:619-625.

[29] Bhandari, M. R., and J. Kawabata. 2004. Organic acid, phenolic content and antioxidant activity of wild yam (Dioscorea spp.) tubers of Nepal. Food Chem. 88:163-168.

[30] Chan, Y. C., C. K. Hsu, M. F. Wang, and T. Y. Su. 2004. A diet containing yam reduces the cognitive deterioration and brain lipid peroxidation in mice with senescence accelerated. Int. J. Food Sci. Technol. 39:p99-107.

[31]Langmead, L., C. Dawson, C. Hawkins, N. Banna, S. Loo, and D. S. Rampton. 2002. Antioxidant effects of herbal therapies used by patients with inflammatory bowel disease: an in vitro study. Alimentary Pharmacology and Therapeutics 16:197-205.

[32] Taira, J., C. Miyagi, and Y. Aniya. 2002. Dimerumic acid as an antioxidant from the mold, Monascus anka. the inhibition mechanism against lipid peroxidation and hemeprotein-meduated oxidation. Biochemical pharmacology. 65:1019-1026.

Table 1. The history and development of monacolin K production of Monascus

Fig. 1. Photograph of Monascus mutant strain screening with Bacillus subtilis

Fig. 2. Time curve of conjugate dienes inhibition by Monascus. purpureus 

HM105 and NTU568