Monascus深层发酵用高色价红曲霉菌株的选育

Monascus深层发酵用高色价红曲霉菌株的选育

杨晓暾  胡文林

广东江门生物技术中心  江门  529080

摘要： 红曲菌代谢物中色素含量的多少，决定着红曲色素产品收率的高低，这与菌种质量的优劣及培养条件的控制有着密切的关系。本文在选育用于深层发酵产色高、色调好的红曲霉优良菌株方面，主要作了以下的研究：选择性地挑选产色菌株；营造不良环境、培养粗放菌株；不断加强菌种复壮纯化。实验结果表明： As3.554等菌株经过多次物理、化学诱变处理后，其色价由原来的180～220u/ml提高到300～350u/ml，最高达420u/ml，深层发酵的菌丝体明显呈紫红色。

关键词：红曲霉  选育  深层发酵  色价

Screening and Mutagenesis of Monascus sp. with High Pigment Production by Submerged Fermentation

Xiaodun Yang¹   Wenlin Hu²

Abstract  The quantity of pigment of Monascus metabolizes determines the quality of pigment of Monascus. It contacts with the quality of strains and cultivation environment. Screening and mutagenesis of good Monascus strains by submerged fermentation researched in these ways: choosing strains producing pigment; constructing bad environment, cultivating extensive strains; enhancing constantly  strains with rejuvenation and purifying. The results indicated that: As3.554 and As3.972 strains were prepared by physics and chemistry mutation, and the pigment increased from 180～220u/ml to 300～350u/ml, and the highest can reached to 420u/ml. Mycelium by submerged fermentation presented amaranth.

Keywords    Monascus sp.      Screening-mutagenesis

Submerged -fermentation     Pigment-value

前言

红曲在中国的生产和应用已有上千年的历史，经过数百年的传代和人工选择，红曲曲种已经达到相当纯粹的程度。20世纪60年代初中国科学院微生物所对红曲进行了分离筛选，获得11株优良菌种在全国推广，红曲的生产逐步采用纯菌种；而90年代初我国采用纯种液体深层发酵生产实现红曲红工业化生产，到目前已形成相当的规模和产量，无论固体发酵法或液体发酵法生产红曲红，都达到较高的发酵水平。但在实际生产过程中，发酵水平越高（即色价越高），生产出的红曲红色泽会偏黄，而用户大都却喜欢紫红色。众所有知，红曲色素的色泽在E^{1 %}_1cm505nm为红色，当OD值由505nm→410nm时，色泽逐渐由红色→橙色→黄色。红曲红产品中紫红色色价却相对低于橙红色色价，这对单纯追求高色价来说似乎有些矛盾。因此，在分离筛选菌株时，我们不仅要考虑其菌株产色高低，还要考虑其产色色调问题。据李钟庆教授等报道，红曲霉菌株有产色与不产色之分，有产色调不同之分（如Monascus albidus、Monascus aurantiacus、Monascus ruber、Monascus purpureus等）。红曲红色素就是利用产色Monascus anka或Monascus purpureus菌株等，在人工控制条件（如培养基浓度、温度、pH值等）、特殊的生长环境下进行发酵生产，经破壁、浸提、精制提炼而成的产物。红曲菌代谢物中色素含量的多少，决定着生产产品收率的高低，这与菌种质量的好坏和培养条件的控制有着密切的关系。因此，如何筛选不同色调、产色高的红曲霉菌株，对提高收率、提高产品品质、降低成本至关重要。结合多年的生产经验和试验摸索，我们认为要筛选产色高、色调纯正的优良菌株，拟从以下几方面着手：

A 选择性地挑选产色菌株：作为食品添加剂着色力强、使用范围广的红曲红色素以紫红色为主，应用厂家也选择鲜亮的玫瑰红或紫红色，为此，我们选择从外观看其色调紫红、培养基上着色力较好的As3.554等作为出发菌株，进行诱变育种。针对色调问题，我们不断摸索和改进菌种培养基配方及发酵工艺，根据摇瓶生长过程中的代谢情况，在原发酵培养基基础上适当增加碳氮比，在不同阶段及时调整培养基的浓度比和pH值，使其代谢产物尽可能呈紫红色。

B 在不良环境下筛选适于粗放培养的菌株：育种的目的，就是要改善菌种的特性，使其能提高产量、改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理等。故在筛选菌种时，主要考虑选择耐高温、发酵周期短、培养粗放、性能稳定的菌株，以适应工厂化生产。通过特殊处理（耐高温、耐高压、耐酸碱）后筛选的红曲霉菌株，在正常环境下生长，可以取得理想效果。如经处理过的菌株，在36~37℃、pH3.0~6.8的条件下也能正常发酵，并能缩短深层发酵周期（65~68h）。

C 不断加强菌种分离复壮工作：在实际生产过程中，使用多代移接的菌种容易发生退化，发酵水平降低、色价下降等，必须及时进行分离复壮。若发现有高色价、高产率大罐发酵液，也要及时进行分离筛选，只有不断加强菌种分离复壮工作，筛选高色价、高质量、高稳定的生产菌株，才有可能有所突破，提高发酵水平。

1 材料与方法

1.1菌株  红曲霉As3.554、As3.2636、As3.2666引自中科院微生物研究所；红曲霉As.4577为李钟庆教授所赠。

1.2培养基

（1）分离培养基PDA：20%马铃薯浸汁1000ml，葡萄糖20g，琼脂 20g    

（2）分离培养基CYA： 蔗糖3%，酵母膏5.0%，K₂HPO₄0.1%，NaNO₃0.3%，KCl0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，FeSO₄·7H₂O0.001%，蒸馏水1000 Ml，1.5%琼脂   

（3）麦芽汁培养基：10^oBx麦芽汁1000ml，20g琼脂

（4）KMA：可溶性淀粉3%，麦芽糖3%，蛋白胨2%，琼脂2%

1.3培养方法

（1）用PDA或CYA培养基进行平板分离培养，温度32~35℃，6~8d；

（2）用麦芽汁或KMA培养基进行试管接种培养，温度32~35℃，6~8d；

1.4选育方法

（1）紫外诱变

将已培养好的试管斜面种，挑入内装有30ml的无菌水的三角瓶，置于摇床振荡30~40min，过滤，取10ml孢子悬浮液，加到Ф9cm的带磁力棒的培养皿内，在磁力搅拌下进行紫外照射（1~10min），涂平板（用黑布包扎），于温度32~35℃下培养6~8d。 

（2）化学诱变

制备孢子悬浮液，用0.01~0.1MHNO₂和1M醋酸（pH4.5）处理，振荡摇匀5~30分钟,再用0.05MNa₂HPO₄作缓冲液(pH8.0)中止反应。涂布平板培养（温度32~35℃、时间6~8d）。

（3）复合诱变

先用亚硝酸处理后终止反应，再经紫外照射1~10min处理。

经上述其中一种诱变方法处理后，观察其菌落形态及特征，将个大、色深，有代表性的单孢菌株跳入试管斜面培养（每个菌落移接2~3支试管），分别用一支试管种进行摇瓶试验（室温32~35℃、时间100~120h），分析检测发酵液（色价、pH）。

再次挑选优良菌株进行多次复筛，选择稳定性好、色价高的菌种作为生产种，置于冰箱保存备用。

（附：用PDA或CYA培养基进行平板分离，麦芽汁或CYA（4）作为斜面培养基进行培养。）

1.5摇瓶试验

1.5.1摇瓶培养基组分

米粉6%～8%，黄豆2%～3%，玉米浆1.0%～2.0%，KH₂PO₄0.2%～0.3%，NaNO₃0.2%～0.3%，MgSO₄0.2%～0.3%，pH3.5～4.0

1.5.2 培养

在500ml三角瓶内装入种子液、发酵液80~100ml，于121℃、灭菌30min，冷却，接种（接种量为4%~5%），于转速为180~200rpm，室温32~35℃，培养24~28h（发酵液4~5d）

1.6 种子培养

1.6.1种子培养基组分

     可溶性淀粉3%、KH₂PO₄0.2%~0.3%，NaNO₃0.2%~0.3%， MgSO₄0.2%~0.3%，黄豆2%~3%，玉米浆1.0~2.0，pH3.5~4.0

1.6.2培养

     培养温度32～35℃，通风量1：0.4，罐压0.04MPa，培养时间27～92h。

2 结果与讨论

经2~3次摇瓶检测结果挑选发酵时间短，产色高、产色紫的菌株作为生产原菌种，并用此种再次接入试管斜面（复壮），待培养成熟后置于冰箱保存，备用。经过多次物理、化学诱变处理后，其色价由原来的180~220u/ml提高到300~350u/ml，最高可达420u/ml，发酵液色调及菌丝明显呈紫红色。实验结果见表1。

表1  工艺条件改变后较理想的5支菌株的生物特性

经多次选育所获的菌株，用于生产色调纯正，发酵水平大幅度提高。但若在生产中工艺条件发生改变，对菌种性能的稳定和产色率影响较大，故仍需做进一步的强化试验，如耐高温（45~55℃）、耐高压（0.8~1.0Mpa）、耐酸碱（pH2.0~3.0或pH8.5~9.5）等方面的驯化，以此增强不良环境下的生存能力，提高大罐发酵水平。在实际生产过程中，须经常注意菌种的分离筛选和复壮工作，同时摸索和改良配方、改进工艺、总结经验，结合具体的生产实际，及时调整分离方法和分离配方，才能保证菌株生化性能的稳定和发酵水平的不断提高，从而获得新的发展。

参考文献

[1] Ching-Fwu Lin.  Isolation and Cultural Conditions of Monascus sp. for the Production of Pigment in Submerged Culture. 1973 , J. No.6, Page:407～414

[2] Siu-Wai Cuiu.  Submerged Production of Monascus pigment. Mycologia. 1993, Vol.85, Page:214～218