红曲提取分离液抑菌性的初步研究

红曲提取分离液抑菌性的初步研究

赵树欣 宫慧梅

(天津科技大学生物工程学院 天津 300222)

摘要：采用不同性质的溶剂提取红曲样品，做抑菌试验，结果表明红曲的水提取液、70%乙醇提取液、95%乙醇提取液、乙酸乙脂提取液等都有不同程度的抑菌作用。但不同提取溶剂的提取物对同一种微生物抑菌效果有差异；同一种溶剂提取物对不同种类微生物的抑菌效果也不同。总的说来，水溶性成份和70%乙醇提取液的抑菌效果要更显著。

为了进一步了解抑菌成分，我们对红曲70%乙醇提取液进行了层析分离。红曲色素经硅胶柱分离后形成红、橙、黄三条色带。用正己烷-乙酸乙酯洗脱黄色部分；乙酸乙酯洗脱橙色部分；甲醇-乙酸乙酯洗脱红色部分。为了解三种组分的纯度，分别对红色组分、橙色组分和黄色组分作了薄层层析。经层析分离后黄色组分走出一个黄色斑点和一个荧光点；橙色组分只有一个橙色斑点；红色组分呈现一个红色斑点和一个荧光点。

分别对以上三种组分的抑菌性进行了研究。供试菌为蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和青霉。结果表明，橙色组分对三种细菌具有很强的抑菌作用，但对酿酒酵母和青霉的生长没有抑制作用。而红色组分和黄色组分则对所有供试菌都基本没有抑制作用。

关键词：红曲霉  提取液  抑菌性

前言

在中国古代的文献中就有关于红曲具有抑菌作用的记载。1977年香港的Wang HC等发现了一种起抑菌作用的物质命名为Monascidin A.。1995年法国的Blanc等实验证明Monascidin A就是橘霉素。国内近十年也有不少研究红曲抑菌性的论文发表。如董明盛等对发酵液、红曲粉的抑菌性作了研究；童群义等用液态发酵生产的红色素作了抑菌性研究。但是对于起抑菌作用的物质的性质仍然了解很少。我们研究室也对这个问题进行了初步研究。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试微生物由天津科技大学菌种保藏室提供

1.1.2供试样品市购

1.1.3所用试剂均为分析纯

1.2方法

1.2.1红曲提取液的制备：准确称取红曲样品1g，分别加入20ml的 70%乙醇、95%乙醇、蒸馏水、乙酸乙酯提取制得。

1.2.2红曲色素分离液制备：将70%乙醇的红曲提取液上硅胶柱分离，形成红、橙、黄三条色带，然后依次洗脱。黄色组分用正己烷：乙酸乙酯洗脱，橙色组分用乙酸乙酯洗脱；红色组分用乙酸乙酯：甲醇洗脱。分别收集分离的黄、橙、红三种组分。

三种组分分别进行薄层层析法展开，观察展开效果。刮取薄板上的展开点，进行扫描。

1.2.3抑菌实验

滤纸片法

a. 将滤纸用打孔机打好，直径为6mm左右。与清洗后的试管、培养皿、吸管一起进行干热灭菌，条件为140℃维持2h。

b..将培养8小时的实验菌株，用无菌水制成含菌数为105个/ml的菌悬液。

取0.5ml的菌液放入相应的平板上，用无菌的涂布器涂布均匀。

c. 将干热灭菌后的滤纸片放入无菌平皿中（每个平皿30片左右），向平皿中加入红曲提取液，浸泡30分钟，加入量以没过滤纸片为宜。取出滤纸片，在40℃条件下干燥15min左右。待滤纸片完全干燥后，从干燥器中取出滤纸片，备用。整个过程要注意无菌操作。

将干燥后的滤纸片，贴到已涂布好菌液的平板上，每个平板贴3-4个滤纸片，每个处理重复3次。细菌置37℃培养24小时，酵母菌28℃培养48小时，霉菌置28℃培养3天。测抑菌圈。

管碟法

管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，主要步骤为：

a.倒底层平板，需要注意的是应选择操作台面的水平位置。操作时需要将融化、灭菌后的培养基，在室温下冷却至60℃左右，然后再倾注到平板上，避免有冷凝水产生；

b.将无菌牛津杯按照一定的顺序摆放在底层平板上；

c.取灭过菌的半固体培养基，在室温下冷却至40℃左右。吸取0.2ml菌数为105个/ml的稀释菌悬液，加入到半固体培养基中，吹吸数次，使菌液与培养基混匀；

d.迅速将混匀的培养基倒入放有牛津杯的底层培养基上，立即摇匀，但应避免产生气泡；

e.半固体培养基完全凝固后，小心的取出牛津杯，应避免带出培养基；

f.用加样枪向孔穴处加入一定量的红曲提取液，放置于培养箱中培养12小时；

g.观察、测量抑菌圈。

                                               加样处

图1管碟法示意图

2结果

2.1不同红曲样品提取液的抑菌性

按以上方法对不同红曲样品提取液的抑菌性进行了检测，结果如下：

表 1  红曲粉样品的抑菌能力

采用相同的方法对红曲红样品的抑菌能力也进行了研究，结果见表2。

表3 红曲红样品的抑菌能力

从以上结果可知，70%乙醇提取液和水提取液有较好的抑菌效果。为了了解各种提取液对不同组分的提取效果，分别检测了各提取液在505 nm 、470 nm和410nm下的吸光值。结果如下：

表3  四种提取液的提取效果

从上表可知，以上四种提取溶剂相比，70%乙醇对各组分的提取效果都比较好，无疑是最佳的提取溶剂。四种溶剂对红曲红样品的提取效果，按照70%乙醇、水溶液、95%乙醇、乙酸乙酯的顺序依次递减；对于红曲粉样品，由强至弱的提取顺序为70%乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯、水溶液。

2.2 分离液的抑菌性

2.2.1分离液的性质，按上述方法制得的三种色素分离液，旋转薄膜浓缩至干，70%乙醇定容至1ml。为鉴定分离液的纯度，将获得的色素利用薄层层析法进行展开分离。其中黄色组分用正己烷：乙酸乙酯展开，出现一个黄色斑点和一个荧光点；橙色组分用乙酸乙酯进行展开，只呈现一个桔黄色斑点；红色组分用甲醇：水展开后，呈现一个红色斑点和一个桔黄色斑点。

刮取薄层上分离得到的黄色、桔黄色和红色斑点，加入70%乙醇多次溶解、离心、分离，收集三种分离液，浓缩至1ml。在300-600nm的范围内进行扫描。所得结果如下图所示。

图1黄色组分在不同波长下的吸光值   图2橙色组分在不同波长下的吸光

图3红色组分在不同波长下的吸光值

2.2.2分离液的抑菌性

将浓缩的三种色素按照管碟法的步骤进行抑菌实验。结果表明；桔黄色素具有较强的抑菌活性，对蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌显示很强的抑菌能力，对酿酒酵母和青霉菌生长不抑制。而黄色素与红色素对以上供试菌基本无抑菌活性。

将获得的橙色组分浓缩，再梯度稀释后进行抑菌实验，了解浓度与抑菌性的关系，结果如下图所示：

图4桔黄色素的吸光度与其抑菌性的关系

可见，橙色组分的抑菌性随其吸光度的增加，而不断增强。说明橙色组分的浓度越大，其抑菌活性越强，橙色组分的抑菌性与其浓度呈正相关的趋势变化。

2.3 Monacolin K的抑菌性

Monacolin K是红曲中的一个倍受瞩目的组分，关于它是否具有抑菌性，尚未见报道。所以本实验利用Monacolin K标准品进行了抑菌实验，所得的实验结果证实，Monacolin K对供试的各种菌均无抑菌作用。

3结论

从以上结果可以得出的结论是：红曲中还存在着除橘霉素以外的其它抑菌活性成分。

参考文献

[1]Wang HC, Pigmentation and antibacterial activity of fast neutron and X-ray-induced strains of Monascus purpureus Went, Plant Physion,1977，60：578-581

[2]董明盛等，红曲霉抑菌作用的探讨，中国调味品 1991，1：11-13

[3]童群义等，红曲色素抑菌作用的研究，食品工业科技 1997，5：25-27

[4]P.J.Blank, Characterization of Monascidin A from Monascus as Citrinin, International Journal of Food Microbioligy  1995,27:201-213

[5]徐尔尼等，红曲霉发酵液抑菌作用的探讨，中国畜产与食品 1998，1：11-12